吳建輝，何貝軒，賈鑫磊，郭美麗（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 3501；.海軍軍醫(yī)大學藥學系，上海 00433）

藥用植物中的次生代謝物是中藥藥效物質的主要來源，已知的植物次生代謝物生物合成途徑有乙酸-丙二酸途徑、異戊二烯途徑、莽草酸途徑等[1]，探究植物生物合成的調控因素不僅能提升藥材的品質，也為中藥有效成分體外合成的工業(yè)化提供可能。

植物晝夜節(jié)律鐘是植物體內應對光照、溫度等外界因素隨晝夜節(jié)律性改變而進化出的一套適應機制[2]，對植物生長發(fā)育具有不可或缺的作用。大量研究表明，如黃酮類化合物合成的相關結構基因表達，也具有明顯的晝夜節(jié)律性特點，受晝夜節(jié)律鐘調控[3-4]。晝夜節(jié)律鐘的核心部分中央振蕩器是MYB 蛋白LHY（late elongated hypocotyl）、CCA1（circadian clock associated 1）和偽應答調控蛋白家族（PRRs，pseudo-response regulators）組成，對維持植物晝夜節(jié)律的穩(wěn)定至關重要[5-6]。

PRRs 基因都帶有2 個保守的結構域，氨基端的響應接受結構域（receiver-like domain，RLD），其結構上與磷酸接受域相似，羧基端帶有的CCT（Constans/Constans-like/TOC1）結構域，這2 個結構域被一個保守程度不高的“可變域”所分隔[7-9]。目前研究發(fā)現(xiàn)在CO、CO-like 以及TOC1 基因中也有帶此類結構域，對于植物開花進程有著重要作用[10-11]。

研究表明PRRs 家族基因具有增加植物抗逆性，影響植物生物量的積累[12-14]，以及調控花發(fā)育及衰老等作用[15]。目前對模式植物中PRRs 基因的研究較多，如在擬南芥以及水稻中的PRRs 基因證明具有調控開花周期的作用[17]，但藥用植物中PRRs 基因的研究則罕見報道。

中藥紅花（Carthami flos）是菊科植物紅花（CarthamustinctoriusL.）的干燥花，有活血化瘀的功效。研究表明，紅花主要藥效物質為黃酮類化合物，如羥基紅花黃色素A(HSYA)、紅花素、槲皮素、山奈酚、野黃芩苷[18]等，目前已有對紅花黃酮類化合物生物合成的關鍵基因查爾酮合酶、查爾酮異構酶、糖基轉移酶等多種研究[19-20]，但調控紅花中黃酮類化合物生物合成途徑的基因未完全明確。驗證晝夜節(jié)律鐘調控紅花中黃酮類化合物的生物合成對提升紅花品質意義重大。

本研究依據(jù)前期紅花轉錄組數(shù)據(jù)庫基因注釋篩選晝夜節(jié)律相關基因，并與紅花黃酮類化合物的積累量進行相關分析，得到具有調控紅花黃酮類化合物生物合成功能的晝夜節(jié)律基因，通過qPCR、液質聯(lián)用(UHPLC-MS)等方法以期闡釋PRRs 基因的特征與功能，為進一步研究晝夜節(jié)律鐘調控紅花黃酮類化合物的生物合成積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物材料：云南巍山紅花品系（編號ZHH0119），種植于海軍軍醫(yī)大學藥學院溫室，溫室條件：恒溫25 ℃，晝夜節(jié)律為16 h 光照/8 h 黑暗。儀器與試劑：熒光qPCR 儀：ABI7500；Phanta Max Master Mix 高保真酶，Trans Top green qPCR super mix，Trans one-step cDNA synthesis super mix 逆轉錄試劑盒(北京全式金公司)；Meitler Toledo 電子天平（十萬分之一量程）；高效液相色譜儀：Agilent1290 Infinty LC system;質譜儀：Agilent 6 538 Accurate Mass。

1.2 紅花總RNA 的提取與cDNA 第一鏈的合成

取用新鮮紅花的花冠，根、莖、葉約100 mg 研磨成粉。依據(jù)Plant Zol 說明書提取總RNA，并用紫外分光光度計測定總RNA 濃度與質量，樣品的A260/A280在1.9～2.1 之內可認為符合后續(xù)實驗要求。將其作為模板逆轉錄合成cDNA 第一鏈，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 紅花PRRs 基因的篩選與克隆

基于紅花轉錄組數(shù)據(jù)庫，結合基因注釋篩選出晝夜節(jié)律相關基因，通過紅花花冠表達譜獲取表達量，與紅花代謝組數(shù)據(jù)庫中不同花期黃酮類化合物的積累量進行Pearson 分析，獲取與黃酮類化合物積累量相關系數(shù)r≥0.7 的晝夜節(jié)律基因進行生物信息學分析，設計引物（表1）進行克隆。PCR 產(chǎn)物進行凝膠電泳，回收含有目的條帶的凝膠，連接載體后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，LBA 平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司測序。

表1 全長克隆引物

1.4 紅花PRR1 生物信息學分析

在NCBI 網(wǎng)站用BLAST 在線分析紅花PRR1全長序列以及編碼蛋白的氨基酸序列進行比對以及同源性分析；在ExPASy 在線工具SOMPA 得出所編碼蛋白的二級結構特征；通過Swiss-Model 同源建模預測蛋白三級結構；在ClustalX 2.1 軟件對其編碼蛋白的氨基酸序列與同源蛋白的氨基酸序列進行多重比對分析；使用相鄰節(jié)點算法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)進化樹，自展分析法（Bootstrap analysis）進行1 000 次重復驗證進化樹可靠性。

1.5 紅花PRR1 基因表達分布特征分析

以紅花根、莖、葉、花4 個部位；花冠開花前3 d（Ⅰ期）、開花1 d（Ⅱ期）、開花3 d（Ⅲ期）、開花5 d（Ⅳ期）4 個時期[12]以及1 d 中8 個時間點（6:00、9:00、12:00、15:00、18:00、21:00、0:00、3:00）的花冠第一鏈cDNA 為模板，設計RT-qPCR 引物，以Ct60s（KJ634810）作為內參基因，進行qPCR 實驗，每個樣品設3 個復孔。

1.6 紅花中黃酮類化合物含量測定

取紅花Ⅲ期單日內4 個時間點（9:00、12:00、15:00、21:00）的花冠烘干至恒重，精密稱取5.00 mg置1.5 ml 離心管，再加入精密量取的1 ml 60%甲醇，室溫放置12 h 后超聲處理40 min，12 000 r/min，10 min離心取上清液，UHPLC-MS 在正、負離子模式下進行檢測（表2），參比離子：正離子模式為121.050 9，922.009 8；負離子模式為119.036 3，966.000 7，數(shù)據(jù)采集與分析使用Agilent MassHunter Analysis4.0軟件。以柚皮素、芹菜素、槲皮素、HSYA、山奈酚、紅花素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及野黃芩素為對照品。

表2 UHPLC-MS 分析方法

1.7 紅花PRR1 蛋白互作體系研究

1.7.1 紅花PRR1 蛋白互作網(wǎng)絡預測

使用STRING 數(shù)據(jù)庫對CtPRR1 基因進行蛋白互作網(wǎng)絡分析，可信區(qū)間設置為0.4。利用Python下的networkX 將互作基因進行可視化。

1.7.2 紅花酵母雙雜cDNA 文庫構建

將紅花cDNA 均一化處理得到紅花酵母雙雜cDNA 文庫，與載體PGADT7 進行同源克隆，產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布LBA 平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落進行菌液PCR 驗證

1.7.3 紅花PRR1 載體構建與酵母轉化

根據(jù)PRR1 ORF 設計同源引物引入BamHI、XhoI 酶切位點。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收，連接酶切載體pGBKT7 轉入大腸桿菌，測序驗證后完成pGBKT7-PRR1 bait 載體的構建。

將pGBKT7-PRR1bait 質粒通過PEG/LiAc 法轉化酵母感受態(tài)細胞，涂布SD 平板，28 ℃培養(yǎng)，挑取單克隆進行菌液PCR 鑒定。將陽性單克隆酵母菌液劃線涂布含有X-α-gal 和Aba 的平板。

1.7.4 酵母雙雜文庫篩選紅花PRR1 互作蛋白

將酵母感受態(tài)細胞、載體DNA、紅花酵母雙雜cDNA 文庫質粒按共轉法混合處理后均勻涂布于SD/-His/-Trp/-Ura 三缺平板培養(yǎng)，挑取單克隆轉移至含有X-α-gal 的SD/-His/-Trp/-Ura 培養(yǎng)基，擴增陽性質粒用于測序以及酵母雙雜驗證。

1.8 統(tǒng)計分析

實驗結果經(jīng)SPSS19.0 軟件處理，計量資料統(tǒng)一表示為（），組間比較采用ANOVA 分析，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 紅花晝夜節(jié)律相關基因的篩選

基于紅花花冠轉錄組數(shù)據(jù)庫的基因注釋，檢索出PRR1、PRR2、ELF3、FT、PHYB、GI、ZTL7 個晝夜節(jié)律基因，將其在花冠不同時期的表達量與紅花代謝組數(shù)據(jù)庫中柚皮素、HYSA、苯丙氨酸、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素、槲皮苷、野黃芩素、槲皮素-3-葡萄糖苷7 個化合物含量進行PEARSON相關性分析，如圖1 所示，PRR1 與紅花中主要黃酮類成分的積累量具有良好的相關性（r≥0.7）。

圖1 紅花晝夜節(jié)律基因與黃酮類物質相關性熱圖

2.2 紅花PRR1 基因全長克隆與生物信息學分析

在紅花全長轉錄組數(shù)據(jù)庫中得到的PRR1 基因全長序列3 201 bp，ORF FINDER 結果顯示開放閱讀框1 549～2 814 bp，編碼421 個氨基酸，命名為CtPRR1（GenBank 登錄號：MW492035），將全長序列進行BLAST，系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析如圖2A，CtPRR1 氨基酸序列與水稻（Oryzasativa L.）OsPRR73氨基酸序列（A2XFB7.2）同源性最高。Prot-param分析PRR1 基因所編碼的蛋白質分子式C1900H3039N611O653S15，分子量為45 300，理論pI=8.52，對PRR蛋白質三維結構預測如圖2B，Prot Scale 分析表明預測PRR1 蛋白為親水性蛋白，無信號肽屬非分泌蛋白；蛋白跨膜性分析預測PRR 不含有跨膜區(qū)域，為非跨膜蛋白。

圖2 CtPRR1 生物信息學分析

2.3 CtPRR1 基因在紅花中的表達特征

qPCR 結果表明（圖3A）在紅花不同部位中，CtPRR1 基因在花中的表達量最高，且與根、莖、葉都有顯著性差異(P<0.05)，對紅花花冠Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的CtPRR1 基因的表達情況進行分析，CtPRR1 在Ⅰ期花冠中表達含量最低；Ⅱ期表達水平略有上升，與Ⅰ期無顯著性差異；Ⅲ期花冠中表達量明顯上升，相比Ⅰ，Ⅱ期具有顯著性差異，Ⅳ期花冠中的CtPRR1 基因表達水平略微下降（圖3B），表明CtPRR1 基因在Ⅲ期花冠中轉錄水平最高，CtPRR1 在不同時間表達量的變化與紅花黃酮類化合物積累量的變化相符[22]。對紅花8 個時間點的花冠CtPRR1 表達量分析發(fā)現(xiàn)CtPRR1 表達量在日間6:00 至18:00 逐漸升高，18:00 達峰值，晚間21:00至2:00 逐漸下降，3:00 最低，表達水平在白天與夜晚兩個連續(xù)的時間周期內呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性(圖3C)。

圖3 CtPRR1 不同部位及不同時間的相對表達量

2.4 紅花中黃酮類化合物含量測定

UHPLC-MS 檢測黃酮類化合物在單日內不同時間的含量變化（圖4），除柚皮素外的7 個化合物在白天含量逐漸降低，而在晚間含量又升至較高的水平，柚皮素則相反在白天升高，晚間下降，但8 個化合物含量變化也呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性，與同時間點CtPRR1 的表達量進行PEARSON 分析得到紅花素（r＝?0.948 5）、山奈酚（r＝?0.942 3）、野黃芩苷（r＝?0.950 4）、HSYA（r＝?0.837 2）、山奈酚-3-O-葡萄糖苷（r＝?0.879 2）、柚皮素（r＝0.741 5）、芹菜素（r＝?0.665 2）、槲皮素（r＝?0.487 6），目前研究認為柚皮素在紅花黃酮類化合物生物合成途徑的上游[20]，而CtPRR1 與柚皮素呈正相關，與其他化合物呈負相關，說明CtPRR1 對整體黃酮類化合物生物合成具有負調控作用而導致柚皮素的積累量增多，進一步說明CtPRR1 參與調控紅花黃酮類化合物的合成。

圖4 單日內不同時間紅花花冠黃酮類物質含量

2.5 CtPRR1 蛋白互作研究

STRING 數(shù)據(jù)庫預測紅花轉錄組數(shù)據(jù)庫中CtPRR1 的互作蛋白，獲得互作蛋白TOC1、PIF3、COP1、ZTL、LHY、ELF4、ELF3、CCA1、GI、PRR5、GRP7、TIC、FKF1、RVE114 個，互作關系網(wǎng)絡如圖5。與PRRs 基因共同參與調控植物生長發(fā)育，調控植物次生代謝途徑。由此獲得了較為完善的紅花晝夜節(jié)律核心元件系統(tǒng)，為進一步探索晝夜節(jié)律調控紅花次生代謝的分子機制提供了依據(jù)。

圖5 CtPRR1 互作蛋白網(wǎng)絡預測

通過酵母雙雜實驗發(fā)現(xiàn)，轉入pGBKT7-PRR bait 質粒的酵母細胞在28 ℃生長4 d 后情況正常。帶有pGBKT7-PRR bait 載體的酵母細胞與構建的紅花cDNA 文庫質粒共轉后，28 ℃培養(yǎng)2 d后可以觀察到藍色菌斑出現(xiàn)，4 d 后出現(xiàn)直徑約2 mm 的藍色單克隆菌斑（圖6），菌液PCR 鑒定為陽性克隆。結果如表3 所示，有2 個熱休克蛋白，3 個AP2 轉錄因子，熱休克蛋白具有增強植物抗逆性的功能，AP2 轉錄因子廣泛參與植物生長發(fā)育，調控體內次生代謝。

表3 酵母雙雜篩選互作蛋白

圖6 酵母雙雜結果

3 討論

紅花作為常用的活血化瘀中藥，對其主要藥效物質黃酮類化合物的生物合成途徑及調控機制的研究越來越多[20]，但目前紅花黃酮類化合物生物合成途徑及調控機制仍未闡明。

本研究首次克隆了一個PRRs 家族基因CtPRR1，生物信息學分析表明其與水稻、擬南芥等其他物種中的PRRs 家族基因序列高度相關，說明紅花中的PRRs 基因具有高度保守性。CtPRR1 基因主要在花中表達且開花后第3 天時表達量最高，與紅花不同花期黃酮類化合物的累積規(guī)律一致，存在顯著相關。我們認為，CtPRR1 調控了紅花黃酮類化合物的生物合成。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，CtPRR1 的單日表達量在日間逐漸升高，晚間逐漸下降；隨著CtPRR1 在單日表達量的升高，芹菜素、槲皮素、HSYA、山奈酚、紅花素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及野黃芩素積累量為白天逐漸降低，晚間逐漸升高。CtPRR1 對紅花這些黃酮類成分的晝夜節(jié)律性積累積起負調節(jié)作用；唯CtPRR1 與柚皮素的積累量呈正相關，可能與柚皮素處于黃酮生物合成途徑的較上游以及參與其他代謝過程并受到其他調控基因的影響有關。

PRRs 與CCA1、LHY 基因作為晝夜節(jié)律系統(tǒng)中的核心元件，對多種植物的晝夜節(jié)律鐘輸出途徑中與黃酮合成結構酶基因具有相互作用[22-23]，本研究發(fā)現(xiàn)紅花CtPRR1 可能受2 個熱休克蛋白，3 個AP2 轉錄因子的影響對黃酮化合物的積累起負調節(jié)作用，豐富了晝夜節(jié)律基因調控黃酮類化合物機制的研究資料。

本研究結果為深入研究紅花晝夜節(jié)律基因對黃酮生物合成途徑的調控機制提供了資料。下一步的工作，我們將采用基因過表達以及基因敲除技術結合代謝物分析，進一步驗證CtPRR1 調控紅花黃酮類化合物生物合成的功能及調控網(wǎng)絡，為闡明CtPRR1 的功能提供重要依據(jù)。