戴建英，尤 巍，田 甜，洪戰(zhàn)英（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院,福建 福州 3501；.海軍軍醫(yī)大學藥學系,上海 00433）

中藥知母（Anemarrhenae rhizoma）為百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloidesBge.)的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱瀉火，肺熱燥咳，滋陰潤燥以及腸燥便秘等作用[1]。知母根莖中含有甾體皂苷類、黃酮類、雙苯吡酮類、木質(zhì)素類、多糖類和生物堿類等多種成分，甾體皂苷類是其首要藥理活性成分。其中新芒果苷、芒果苷等黃酮苷類單體成分具有降低血糖的作用，知母皂苷BⅡ以及知母皂苷AⅢ等甾體皂苷類單體成分具有改善學習記憶、抗老年癡呆的作用[2]。

《中國藥典》（2020 年版）將芒果苷和知母皂苷BⅡ作為知母的質(zhì)量評價指標[3]，目前知母中芒果苷和新芒果苷的含量測定方法多采用高效液相-紫外檢測法，而知母中另外一類重要的活性成分甾體皂苷類，由于不存在共軛結(jié)構(gòu)、缺少紫外吸收，需通過衍生化技術將其轉(zhuǎn)化成有紫外特征吸收的物質(zhì)；但這種操作復雜、耗時，且準確度受衍生物穩(wěn)定性的影響較大[4-5]，因此紫外檢測器并不適用于甾體皂苷類物質(zhì)的檢測。相比于紫外檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）不要求化合物帶有發(fā)色團或熒光基團，能夠測定沒有紫外吸收或為紫外末端弱吸收的樣品；而且可以在多溶劑梯度的情況下獲得穩(wěn)定的基線和較高的分辨率。目前，已有應用HPLCELSD 法對知母藥材中單種成分或多成分含量測定的報道[6-7]，但是所建立的方法往往分析時間較長，消耗試劑較多。

本文建立了一種快速、簡便、準確的HPLCELSD 方法，可同時測定知母中3 個黃酮類成分（新芒果苷、芒果苷、寶藿苷Ⅰ）和2 個甾體皂苷類成分（知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ）的含量，可為知母藥材質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（1260 InfinityⅡ Prime LC,美國安捷倫公司）；蒸發(fā)光散射檢測器（G4260B，美國安捷倫公司）；分析天平（XS205，梅特勒-托利多國際公司）、渦旋混合器（SCILOGEX MX-S，美國Scilogex 公司）、超聲波清洗器（2300TH 型，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 試藥

新芒果苷對照品（批號：3671）、芒果苷對照品（批號：5586）、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌罚ㄅ枺?369）、寶藿苷Ⅰ對照品（批號：1869）、知母皂苷AⅢ對照品（批號：3892）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；知母藥材由上海市食品藥品檢驗所中藥室贈予；色譜純乙腈（北京迪科馬科技有限公司）；色譜純異丙醇（上海安譜實驗科技股份有限公司）；分析純乙醇和乙酸（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液

精密稱取芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、寶藿苷Ⅰ和知母皂苷AⅢ 對照品適量，置于5 ml容量瓶中，加50%乙醇溶液適量，超聲溶解后，加入50%乙醇稀釋并定容得到混合溶液，精密量取1 ml該混合溶液置于5 ml 容量瓶中，加50%乙醇溶液定容，最終得含芒果苷464 μg/ml，新芒果苷482 μg/ml，知母皂苷BⅡ 1 084 μg/ml，寶藿苷Ⅰ 106 μg/ml，知母皂苷AⅢ 200 μg/ml 的混合對照品儲備液，搖勻備用。

2.1.2 供試品溶液

取知母藥材適量，干燥后粉碎，過3 號篩得知母藥材粉末。取藥材粉末0.5 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 ml，稱重，超聲（功率300 W，60 Hz）處理30 min。超聲結(jié)束后放置至室溫后再次稱定質(zhì)量，使用50%乙醇補足所減失的質(zhì)量，搖勻后濾過。取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent poroshell 120 EC-C18柱（2.1×100 mm，2.7 μm）；流動相為乙腈(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脫程序設定為0～3 min，4%～10%A；3～5 min，10%A；5～7 min，20%A；7～11 min，20%～25%A；11～14 min，25%～90%A；14～18 min，90%A；18～19 min，90%～4%A；19～20 min，90%～4%A。柱溫為30 ℃；流速為0.7 ml/min。蒸發(fā)光散射器的參數(shù)設定霧化氣溫度為40 ℃；漂移管溫度為90 ℃；氮氣體積流量為2.0 ml/min。供試品進樣量為20 μl?；旌蠈φ掌泛凸┰嚻飞V圖見圖1，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、寶藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ 的保留時間分別為4.05、5.49、11.63、13.85、14.38 min，各成分之間分離度均>1.5。

圖1 知母混合對照品(A)和樣品(B)的HPLC-ELSD 色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系

精密量取1.6 ml 混合對照品儲備液和0.4 ml 50%乙醇溶液，渦旋30 s 混勻，后使用50%乙醇依次對半稀釋。按上述色譜條件進行測定，以峰面積（A）的對數(shù)值與進樣濃度（C）的對數(shù)值進行線性回歸，考察結(jié)果見表1，表明知母中各成分在相應的濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關系。

表1 知母中5 種成分線性回歸方程和線性范圍

2.3.2 精密度試驗

精密吸取混合對照品20 μl，按上述色譜條件連續(xù)進樣6 次，計算5 種成分峰面積的RSD 值，結(jié)果顯示，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、寶藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的RSD 分別為1.3%、1.0%、0.9%、1.5%、1.0%、1.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗

稱取知母藥材粉末0.5 g，精密稱定，平行稱取6 份，按上述操作制備供試品溶液，進樣測定，計算新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、寶藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的含量分別為1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%，RSD 分別為1.8%、1.8%、1.4%、2.2%、2.4%，顯示方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

稱取知母藥材粉末0.5 g，按上述操作制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，結(jié)果顯示新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、寶藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的峰面積RSD 分別為：2.3%、1.3%、0.9%、3.1%、1.8%，說明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗

稱取知母藥材粉末0.25 g，精密稱定，平行稱取6 份，分別加入與知母藥材粉末各成分含量相近的混合對照品溶液，按上述操作制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表2，知母中5 種成分的平均回收率為101.8%～105.0%，表明該方法準確度良好。

表2 知母中5 種成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.3.6 樣品含量測定

稱取知母藥材粉末0.5 g，精密稱定，按上述操作進樣測定，計算各成分含量，最終計算得新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、寶藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的平均含量分別為1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。

3 討論

3.1 流動相系統(tǒng)選擇

本研究首先采用乙腈-水作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新芒果苷、芒果苷峰形不佳，色譜峰出現(xiàn)分叉現(xiàn)象?？紤]到該兩種物質(zhì)呈弱酸性，故采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作為流動相以抑制其解離，結(jié)果顯示其分叉現(xiàn)象消失，各峰之間的分離度良好，且基線平穩(wěn)，因此最終采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作為最終流動相系統(tǒng)。結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同流動相系統(tǒng)對新芒果苷（1）和芒果苷（2）的影響

3.2 氮氣流速考察

流動相流出色譜柱后在載氣壓力的作用下與霧化氣體（氮氣）在霧化室內(nèi)混合形成細小的液滴（氣溶膠），氣體流量越低，形成的液滴越大，散射光越多，分析靈敏度增加，反之越小。但是較低的氣體流量會造成溶劑難以蒸發(fā)，因此本研究考察了氮氣流速分別為1.5、2.0、2.5 L/min 時各待測物質(zhì)的響應值，結(jié)果顯示，當?shù)獨饬魉贋?.0 L/min 時待測物質(zhì)響應值最大，信號噪音比率最大，適合分析。

3.3 漂移管溫度考察

漂移管溫度的設置主要取決于流動相的構(gòu)成、樣品的揮發(fā)性以及流動相的流速。一般來講，對于有機溶劑含量比例高、流速低的流動相，其要求的漂移管溫度也低。本研究使用含新芒果苷386 μg/ml、芒果苷371 μg/ml、知母皂苷BⅡ 867.2 μg/ml、寶藿苷Ⅰ 84.8 μg/ml、知母皂苷AⅢ 160 μg/ml 的混合對照品溶液，考察了漂移管溫度分別為80、90、100 ℃時各待測物質(zhì)的響應值，結(jié)果表明當漂移管溫度為90 ℃時各物質(zhì)峰面積響應值均較大，信號噪音比率最大，適合分析，因此最終漂移管溫度采用90 ℃。結(jié)果如圖3 所示。

圖3 漂移管溫度對待測物質(zhì)響應值的影響

本研究建立了一種同時測定知母藥材中包括芒果苷、知母皂苷BⅡ在內(nèi)的5 種活性成分含量的HPLC-ELSD 方法。該法快速、簡便、準確度高，可為知母的質(zhì)量評價和質(zhì)量標準的提升提供科學依據(jù)，為知母有效成分的體內(nèi)動態(tài)變化研究提供測定方法。