戴瑋莉，金 嬰，王 婷，唐曉萌，顧 清（.上海市靜安區(qū)閘北中心醫(yī)院藥劑科,上海 00070；.山東中醫(yī)藥大學藥學院,山東 濟南 5055；.海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科,上海 004）

小檗堿是從毛茛科植物根莖中提取的一種季胺類異喹啉類生物堿，又稱黃連素，為中藥黃連的主要成分，臨床多用其鹽酸鹽。鹽酸小檗堿（BBR）的藥理作用主要為清熱解毒，屬于傳統(tǒng)的消化系統(tǒng)用藥，臨床上常用作抗菌劑，用于治療細菌性痢疾、腸胃炎等腸道感染[1-2]。鹽酸小檗堿溶解度低，滲透性差，在口服給藥時，還存在藥物釋放快、半衰期短、生物利用度低等缺陷。對于需要達到一定血藥濃度為療效前提的疾病來說，鹽酸小檗堿的傳統(tǒng)劑型還無法達到理想的治療效果[3]。

納米乳（NE）是由油相、水相、表面活性劑、助表面活性劑組成的脂質(zhì)納米給藥載體。粒徑范圍為1～100 nm，液滴呈大小均勻的球形，外觀呈透明或半透明。納米乳是一種熱力學穩(wěn)定的膠體分散體系，制備工藝簡單，所需能量低甚至能夠自發(fā)形成。納米乳處方中油相和表面活性劑、助表面活性劑等組成成分的增溶效果，可以顯著提升難溶性藥物的溶解度。納米乳小且均勻的粒徑，可透過胃腸道的水化層，改善胃腸上皮細胞對藥物的吸收。納米給藥體系具有較低的表面張力，可提高膜的通透性，促進藥物吸收，提高其生物利用度[4]。納米乳自身的獨特優(yōu)勢，使其具有廣泛的臨床應用范圍，可通過口服、透皮、注射等多種途徑給藥[5-6]。

本研究結(jié)合納米乳劑型的優(yōu)勢，制備了鹽酸小檗堿口服納米乳(BBR-NE)，采用偽三元相圖法和星點設計-效應面法優(yōu)化了制備工藝，并對其體外特性進行表征，從而解決鹽酸小檗堿口服給藥劑型溶解度差、生物利用度低等問題，提高藥物的療效，為小檗堿的臨床應用提供新的給藥劑型[4]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

101A-2 型干燥箱（上海實驗儀器總廠）；AG285 十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SB100D 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1 100 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；EPPENDORF 5804R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；Zetasizer Nano ZS90 測定儀（英國馬爾文公司）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿原料藥（批號XC20170113，西安小草植物科技有限公司）；鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201212，純度>86.7 %，中國食品藥品檢定研究院）；1,2-丙二醇（批號20181008，上海凌峰化學試劑有限公司）；吐溫-80（批號2015021，上海凌峰化學試劑有限公司）；甘油（批號20191110，上海源葉生物科技有限公司）；聚乙二醇400（PEG400，批號970248，上海浦東高南化工廠）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH-40，批號19523275L0，德國 BASF 公司）；烷基糖苷0810（APG，平均聚合度1.2～1.8，批號170502，上海發(fā)凱化工有限公司）；丙二醇單辛酸酯（Capryol 90，批號170857，上海嘉法獅貿(mào)易有限公司）；肉豆蔻酸異丙酯（IPM，批號F20160731，國藥集團化學試劑有限公司）；橄欖油（批號F20180725，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）；中鏈脂肪酸（MCT，批號193717，嘉法獅（上海）貿(mào)易有限公司）；大豆油（批號20190801，江西金海棠藥用油有限公司）；蓖麻油（批號20180815，上海凌峰化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA 有限公司）；羥丙甲基纖維素（HPMC，批號H08827，阿拉丁生化科技股份有限公司）；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿HPLC 含量測定方法的建立[7-8]

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.05 mol/L 與磷酸二氫鉀（0.5 %三乙胺，磷酸調(diào)至pH=3）等度洗脫，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外檢測波長345 nm，柱溫25 ℃，進樣量20 μl。

2.1.2 方法學考察

精密稱取鹽酸小檗堿對照品1.0 mg，用甲醇稀釋定容于10 ml 量瓶中作為儲備液，用甲醇逐級稀釋成系列對照品溶液，按上述色譜條件進樣測定。稱取適量鹽酸小檗堿納米乳于10 ml 量瓶中，加入甲醇超聲破乳30 min，10 000 r/min 離心5 min，取1 ml上清液于10 ml 量瓶中，加甲醇定容后過0.45 μm微孔濾膜即得供試品溶液。方法學考察表明，鹽酸小檗堿在1.00～100.00 μg/ml 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，回歸方程為：Y=37.059X+16.952（r=0.999 9）。低、中、高濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液的日內(nèi)精密度分別為0.68 %、1.64 %、0.80 %，日間精密度分別為0.95 %、0.23 %、013 %，加樣回收率RSD 分別為1.42 %、0.70 %、1.57 %，表明該方法可用于納米乳中鹽酸小檗堿的含量測定。

2.2 鹽酸小檗堿納米乳的制備[4]

2.2.1 油相、表面活性劑和助表面活性劑的篩選

采用水滴加法制備鹽酸小檗堿納米乳。根據(jù)各類溶劑口服的安全性，篩選出以下各相備選溶劑，以BBR 的溶解度為指標，確定各相最佳選擇。

油相：Capryol 90、蓖麻油、橄欖油、大豆油、IPM、MCT；表面活性劑：吐溫-80、APG、RH-40；助表面活性劑：1,2-丙二醇、PEG400、甘油。在具塞玻璃離心管中加入5 ml 上述各溶劑與過量鹽酸小檗堿，置于恒溫（25 ℃）振蕩器振搖（100 r/min）72 h，得到以上各溶劑的飽和鹽酸小檗堿溶液。取該飽和溶液于5 000 r/min 條件下離心10 min，吸取1 ml上清液置于5 ml 量瓶中，加甲醇稀釋定容之后過0.45 μm 微孔濾膜，按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測。

結(jié)果如圖1 所示：油相中鹽酸小檗堿的溶解度從大到小依次為：Capryol 90>MCT>蓖麻油>大豆油>橄欖油>IPM；表面活性劑的順序為：吐溫-80>APG>RH-40；助表面活性劑的順序為：1,2-丙二醇>甘油>PEG400。即鹽酸小檗堿在Capryol 90、吐溫-80、1,2-丙二醇中溶解度最大，故選擇Capryol 90 為油相，吐溫-80 為表面活性劑，1,2-丙二醇為助表面活性劑。

圖1 鹽酸小檗堿在各相溶劑中的溶解度

2.2.2 表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比（Km）的篩選

按照上述篩選的結(jié)果，將表面活性劑和助表面活性劑按照Km分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1 的比例混合，再取油相與此混合表面活性劑按照1∶9、2∶8；3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 的質(zhì)量比配制成混合溶液，在磁力攪拌下滴加蒸餾水。觀察溶液的顏色、乳光和澄明度，判斷臨界點，記錄體系由渾濁變澄清時的加水量，計算臨界點時各組分的比例。用Origin 10.0 軟件繪制偽三元相圖，圖中各臨界點連線下方的區(qū)域即為納米乳區(qū)，比較該區(qū)域面積大小，確定表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比[9-11]。結(jié)果見圖2。圖中陰影部分即為成乳區(qū)，且當Km為2∶1 時達到最大，故將Km定為2∶1。然而在實際制備納米乳過程中，處方中各組分的不同比例會產(chǎn)生交互影響作用，因此，需要進一步采用星點設計-效應面法優(yōu)化鹽酸小檗堿納米乳的制備工藝。

圖2 不同Km 值BBR 納米乳的偽三元相圖

2.2.3 星點設計-效應面法優(yōu)化鹽酸小檗堿納米乳處方[4]

選擇對納米乳影響較大的表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比Km（X1）和油相質(zhì)量百分數(shù)（X2）作為考察因素，以多分散系數(shù)（PDI，Y1）和載藥量（Y2）為考察指標。實驗過程中發(fā)現(xiàn)當Km≥4 時，大部分處方難以成乳；當Km≤1:2 時，平均粒徑>100 nm，故將Km范圍定在1∶1 至3∶1。當含油量增至0.5 g（50 %）時，平均粒徑已接近100 nm，而當含油量范圍在0.2～0.5 g（20 %～50 %）時，可將粒徑控制在100 nm 之內(nèi)。根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定了Km的取值范圍和油相質(zhì)量百分數(shù)，并將兩個評價指標進行歸一化，將每個指標換算成0～1 之間的“歸一值（OD）”,并求算幾何平均數(shù)，得總評“歸一值”。計算公式如下:OD=(d1d2d3…...dk)1/k（k 為指標數(shù)）。對取值越小越好的因素（PDI）和取值越大越好的因素（載藥量）采用Hassan 法[9]分別進行數(shù)學轉(zhuǎn)換，求歸一值dmin和dmax，公式如下：dmin=(Ymax?Yi)/(Ymax?Ymin)；dmax=(Yi?Ymin)/(Ymax?Ymin)。采用2 因素5 水平星點設計優(yōu)化處方，因素水平見表1，星點設計各組實驗結(jié)果見表2。

表1 星點設計因素水平表

表2 星點設計各組實驗結(jié)果

對X1進行二次式回歸，得到方程R1=0.23+0.06A+3.22×10?3B?2.75×10?3AB+0.03A2+0.03B2，（r=0.970 8），P<0.001；對X2進行二項式回歸，得到方程R2=0.81?0.04A+0.06B+1.37×10?3AB?0.01A2+0.01B2，（r=0.913 5），P<0.05；對總歸一值（OD）進行二項式回歸，方程為OD=0.87?0.28A+0.03B?0.01AB?0.03A2?0.34B2，（r=0.910 2），P<0.05。以OD 作為指標時，為使方程有效，對其進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3 可知，模型的P<0.05，說明OD 與X1、X2回歸方程的非線性關系顯著?；貧w方程的相關系數(shù)r=0.910 2，表明模型能說明91.02 %響應值的變化，擬合情況良好，回歸方程具有較好的代表性，能準確預測實際情況[12]。

表3 星點設計-效應面法優(yōu)化納米乳處方方差分析表

由擬合曲線可繪制X1、X2和OD 值的關系，所繪制的三維效應面和二維等高線如圖3 所示。利用Design Expert 8.0 軟件的預測分析功能，根據(jù)擬合回歸方程、三維效應面圖和二維等高線圖綜合分析，得到最佳處方為X1=0，X2=0.53，預測值OD 為0.621 4。故優(yōu)化后的鹽酸小檗堿納米乳處方為：油相Capryol 90 占體系的32.84 %，表面活性劑吐溫-80 占體系的33.90 %，助表面活性劑1,2-丙二醇占體系16.95 %，水相占體系15.25 %[4]。

圖3 因變量Y 隨自變量X 變化的三維效應面和二維等高線圖（a）X1，X2，Y1；（b）X1，X2，Y2；（c）X1，X2，OD。

2.2.4 最優(yōu)處方的驗證

對最優(yōu)處方進行處方驗證，結(jié)果如表4 所示，預測值OD 為0.621 4，實際OD 值為0.651 0，偏差為4.76 %。表明預測值與實測值之間偏差較小，表明星點設計-效應面法（CCD-RSM）可用于篩選鹽酸小檗堿納米乳，篩選的處方預測良好、可靠。

表4 最優(yōu)處方驗證結(jié)果

2.3 鹽酸小檗堿納米乳的體外表征[4]

2.3.1 BBR-NE 載藥量的測定

取適量BBR-NE 于10 ml 量瓶中，加甲醇超聲破乳30 min，加甲醇稀釋定容。4 ℃離心（10 000 r/min，5 min），吸取1 ml 上清液置于10 ml 容量瓶中，加甲醇稀釋定容后即得樣品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，計算納米乳的載藥量。測定結(jié)果如表5。

表5 鹽酸小檗堿納米乳的載藥量測定結(jié)果(±s，n=3)

表5 鹽酸小檗堿納米乳的載藥量測定結(jié)果(±s，n=3)

2.3.2 BBR-NE 粒徑大小與分布的測定

按照最優(yōu)處方制備BBR-NE，稀釋到適宜濃度，均勻分散后，采用馬爾文激光粒度分析儀測定納米乳的粒徑大小。粒徑結(jié)果如圖4 和圖5 所示。所制備的BBR-NE 粒徑分布范圍窄且呈正態(tài)分布，平均粒徑為（68.85±8）nm，PDI 為(0.245±0.03)，表明該制劑粒徑分布及均勻性均符合納米乳制劑要求。

圖4 最優(yōu)處方（201119）納米乳粒徑分布圖

圖5 最優(yōu)處方（201119）納米乳電位分布圖

2.3.3 BBR-NE 的形態(tài)學考察

采用透射電鏡（TEM）觀察所制備的BBRNE 的形態(tài)。取適量BBR-NE 滴于銅網(wǎng)上，自然干燥后滴加2 %磷鎢酸（pH=7.4）溶液于銅網(wǎng)上負染3 min，晾干后置于透射電鏡下觀察其外觀形貌。最優(yōu)處方制備的納米乳的透射電鏡如圖6 所示。結(jié)果表明，BBR-NE 呈均一圓整的球形，具明顯層狀結(jié)構(gòu)，粒徑大小約為68 nm。

圖6 最優(yōu)處方（201119）納米乳的透射電鏡圖

2.3.4 BBR-NE 體外釋放度的測定[4]

取制備好的鹽酸小檗堿納米乳2 ml，置于透析袋（分子截留值為7 000）中。于pH 1.2 的人工胃液中釋放2 h，再于pH 6.8 的人工小腸液中釋放22 h，溶出介質(zhì)體積滿足漏槽條件。將透析袋置于離心管中（含30 ml 透析液），在恒溫振蕩器（37 ℃，100 r/min）中釋放24 h，分別于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h 定時取樣1 ml，隨后立即補加等溫等體積釋放介質(zhì)。收集的樣品過0.45 μm 濾膜后，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算累積釋放度。釋放曲線如圖7 所示，擬合方程如表6 所示。

表6 鹽酸小檗堿納米乳釋藥曲線的擬合方程

圖7 鹽酸小檗堿納米乳的體外釋放曲線 (±s，n=6)

由釋放曲線可以看出，BBR-NE 在人工胃液中（0～2 h）累積釋放度很低（<20%），進入人工小腸液后（2～24 h）釋放度逐漸上升，累積釋放度達到80 %以上，表明該制劑具有一定緩釋效果，其釋藥行為符合一級動力學方程。

3 討論

納米乳的處方篩選過程中，目前常采用繪制偽三元相圖、正交試驗設計法、星點設計-效應面法等方法。其中，偽三元相圖法的精度不高，常用于初篩[13-14]；正交試驗設計法在因素水平較少時試驗次數(shù)雖不多，但由于采用線性模型擬合，預測性較差[15]；而星點設計-效應面法各因素對效應的影響擬合結(jié)果多數(shù)是非線性，可從效應面上選擇最佳效應區(qū)域，適合于多因素、多水平的處方優(yōu)化。

在應用偽三元相圖篩選Km時，隨著表面活性劑和助表面活性劑質(zhì)量比的增加，形成納米乳區(qū)域的面積逐漸增加，當Km為2∶1 時最大，而后稍有減小。這是由于加入吐溫-80 的比例增加，納米乳的乳化作用增強。因此需要綜合考慮選擇最佳的Km值。

本研究在單因素篩選的基礎上，利用星點設計-效應面法，以載藥量及外觀形態(tài)為考察指標，優(yōu)化并確定了鹽酸小檗堿納米乳的最優(yōu)處方：油相Capryol 90 占體系32.84 %，表面活性劑吐溫?80 占體系33.90 %，助表面活性劑1,2-丙二醇占體系16.95 %，水相占體系15.25 %，載藥量為0.829 mg/g。外觀形態(tài)分析，表明所制備的BBR-NE 呈圓整均一的球體且具有明顯的層狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑為 (68.85±8) nm，呈正態(tài)分布，多分散系數(shù)為(0.245±0.03)，說明該制劑粒徑大小符合納米乳粒徑要求且均勻性好[4]。由驗證試驗結(jié)果可知，該制備工藝穩(wěn)定可行，有望為鹽酸小檗堿臨床應用提供一種新的給藥劑型。