朱天寶，涂 杰，盛春泉，徐德鋒，劉 娜（.常州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 常州 364；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 00433）

近年來，隨著腫瘤、器官移植和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)等導(dǎo)致的免疫功能低下人群的增加，侵襲性真菌感染（IFIs）的發(fā)病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隱球菌和曲霉菌是IFIs 最主要的致病菌，并且造成的病死率超過90%[3]。在念珠菌屬中，白念珠菌（Candida.albicans）是院內(nèi)血液感染最常見的致病菌原體，其在重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者中致病率超過17%，病死率高達(dá)40%[4-5]。臨床上治療IFIs 的抗真菌藥物主要包括：多烯類（兩性霉素B）、核酸類（5-氟胞嘧啶）、唑類（氟康唑）和棘白菌素類（卡泊芬凈）藥物（圖1）[6-7]。然而，由于臨床上出現(xiàn)抗真菌藥物嚴(yán)重的耐藥性和毒副作用，IFIs 的治療效果相當(dāng)有限。因此，迫切需要研發(fā)全新機(jī)制的抗真菌藥物。

圖1 臨床上治療IFIs 的抗真菌藥物

組蛋白乙?；揎棧òńM蛋白乙酰化和去乙?；┦潜碛^遺傳學(xué)研究的重要組成部分。組蛋白去乙?；福℉DACs）將組蛋白和其他蛋白上的賴氨酸末端乙?；コ?，對染色體重塑和基因的表達(dá)起著重要作用[8-9]。目前HDAC 抑制劑主要集中于抗腫瘤研究方向，且已有多個上市藥物應(yīng)用于腫瘤的治療。據(jù)研究報道，真菌中的HDACs，如煙曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、釀酒酵母[13]和新生隱球菌的HDACs[14-15]參與了毒力相關(guān)的過程和形態(tài)變化。因此，抑制真菌HDACs 可能是治療IFIs 的有效策略。

聯(lián)合藥物治療是提高臨床一線藥物療效并克服真菌耐藥性的有效策略之一。真菌的耐藥性涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，其中染色體重塑和組蛋白修飾起主要作用。HDACs 調(diào)節(jié)的組蛋白修飾在應(yīng)激信號通路中起著至關(guān)重要的作用，這可能與真菌對各種環(huán)境（包括藥物）的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[16]。此外，已有研究報道，HDAC 抑制劑與唑類藥物聯(lián)用具有協(xié)同增效作用[17-18]。例如，HDAC 抑制劑MGCD290 與氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同抗多種臨床真菌分離株的作用[19]。

基于此，本研究首先對8 個市售的HDAC 抑制劑（圖2）進(jìn)行體外協(xié)同抗真菌活性測試，篩選結(jié)果顯示化合物Rocilinostat 與氟康唑聯(lián)用具有優(yōu)秀的體外協(xié)同抗耐藥白念珠菌活性。后續(xù)考察其與不同唑類藥物聯(lián)用時對不同念珠菌屬的體外協(xié)同抗真菌活性，以及對正常細(xì)胞的毒性作用，以期為抗真菌藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

圖2 HDAC 抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料和方法

1.1 實驗試劑與菌株

臨床分離的6 株唑類耐藥白念珠菌（編號：9893，10061，10060，9173，4108 和0304103），2 株唑類耐藥熱帶念珠菌（編號：5008，10086），1 株光滑念珠菌（編號：9073）和1 株耳道念珠菌（編號：0029）由海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院提供。菌株活化首先從?80 ℃中挑取菌株凍存液至YEPD 液體培養(yǎng)基活化24 h,然后取10 μl 菌懸液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)16 h 后待用。HUVEC細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，并在新鮮配置的DMEM 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

YEPD 液體培養(yǎng)基：取10 g 酵母浸膏、20 g 葡萄糖、20 g 蛋白胨溶解于1 000 ml 三蒸水中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121 ℃,15 min）后，保存于4 ℃條件下備用。RPMI 1 640 培養(yǎng)基：取10 g RPMI 1 640（Gibco）粉末、34.5 g 嗎啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH 溶解于1 000 ml 三蒸水中，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾與滅菌后，置于4 ℃條件下保存和備用。DMEM 完全培養(yǎng)基：按照89% DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%的雙抗比例混勻制得，混勻后置于4 ℃條件下保存和備用。PBS 緩沖液：10 × PBS 100 ml 溶解于900 ml 三蒸水中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121 ℃,15 min）后，置于4 ℃條件下保存和備用。

1.2 儀器

THZ-92A 氣浴恒溫振蕩器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、MJ-150-I 霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、LW100T 生物顯微鏡（北京測維光電技術(shù)有限公司）、HDC-15K 高速離心機(jī)（上海泰坦科技股份有限公司）、C170 二氧化碳培養(yǎng)箱（BINDER GmbH）、infinite M200 多功能酶標(biāo)儀（Tecan Austria GmbH）、高壓蒸汽滅菌鍋、無菌潔凈工作臺。

1.3 棋盤式微量液基稀釋法

本實驗參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）公布的M27-A3 方案中微量液基稀釋法進(jìn)行。首先，收集活化好的真菌細(xì)胞，PBS 洗3 次后用RPMI 1 640 培養(yǎng)基制成濃度為1×103CFU/ml的菌懸液。按照每孔100 μl 接種菌懸液至無菌96 孔板中，1～9 列加入倍半稀釋的HDAC 抑制劑，A～F 行加入倍半稀釋的氟康唑，其中G 行只加氟康唑，第10 列只加化合物，第11 列為不加藥的陰性對照組，后將96 孔板置于35 °C 條件下孵育48 h。測定每孔在630 nm 處的吸光度A，依據(jù)公式：抑制率（%）=（A陽性對照孔?A化合物孔）/（A陽性對照孔?A陰性對照孔）× 100%，計算各孔對應(yīng)的抑制率。如果某一孔和其左邊孔對應(yīng)的抑制率均大于80%，則該孔對應(yīng)的化合物和FLC 濃度分別作為FIC化合物和FIC氟康唑，利用協(xié)同指數(shù)公式：FICI=（FIC化合物./MIC80化合物）+（FIC氟康唑/MIC80氟康唑），計算各化合物對應(yīng)的FICI。

1.4 時間-生長曲線實驗

收集活化好的白念珠菌0304103 稀釋在RPMI 1640 培養(yǎng)液中，保持菌濃度為1×105CFU/ml。取5 ml 稀釋的菌懸液和不同濃度的待測藥物加入50 ml 的離心管中,DMSO 組作為空白對照組和32 μg/ml FLC 作為陽性對照。隨后將50 ml 的離心管置于30 °C 條件下振蕩培養(yǎng)（200 r/min），在多個時間點(diǎn)吸取不同藥物組的真菌混懸液（100 μl）于96 孔板上，測量A630值并使用GraphPad Prism 7 作圖。

1.5 真菌細(xì)胞總HDAC 酶活性測試實驗

收集指數(shù)生長期的白念珠菌0304103 細(xì)胞（濕重為100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巰基乙醇和3 ml snailase 反應(yīng)緩沖液等新鮮配置的真菌裂解液來處理它們，以制備真菌原生質(zhì)體。真菌原生質(zhì)體分散在PBS（20 ml）中以獲得混懸液，然后往96 孔板每孔中加入100 μl 的混懸液和不同濃度的化合物Rocilinostat，并在35 °C 下培育12 h。接著往每個孔中加入30 μmol/L 的HDAC 底物，于37°C 下孵育6 h。隨后添加100 μl HDAC 酶促終止溶液并在37°C 下孵育2 h。最后，在每個孔中取出100 μl 培養(yǎng)物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm 來監(jiān)測熒光強(qiáng)度并記錄下來用于計算HDAC 酶的抑制率。

2 結(jié)果

2.1 化合物Rocilinostat 與氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同抗真菌活性

表1 列出了HDAC 抑制劑單獨(dú)使用或與氟康唑聯(lián)合使用的體外抗真菌活性篩選結(jié)果。MIC80為抑制80%真菌細(xì)胞生長的最低藥物濃度。實驗結(jié)果表明，8 個HDAC 抑制劑單獨(dú)使用對耐藥白念珠菌均無直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立諾他（FICI=0.125）與FLC 聯(lián)用時均表現(xiàn)出良好的協(xié)同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat 的協(xié)同活性最佳，值得進(jìn)一步研究。

表1 單用HDAC 抑制劑或者與氟康唑聯(lián)用對白念珠菌0304103 的體外抗真菌活性(μg/ml)

2.2 Rocilinostat 與氟康唑或伏立康唑聯(lián)用對多種白念珠菌的抗真菌活性

為進(jìn)一步考察Rocilinostat 是否具廣譜的抗真菌作用，挑選9 株臨床分離的念珠菌屬菌株進(jìn)行協(xié)同抗真菌活性測試。如表2 所示，Rocilinostat 與FLC 聯(lián)合使用時，對兩株耐FLC 的白念珠菌（C.albicans9 173，F(xiàn)ICI=0.094;C.albicans4 108,FICI=0.5）和對FLC 敏感的光滑念珠菌（C.glabrata9 073）表現(xiàn)出協(xié)同增效作用，而對熱帶念珠菌（C.tropicis）和耳道念珠菌（C.auris）沒有協(xié)同抗真菌活性。當(dāng)Rocilinostat 與伏立康唑（VRC）聯(lián)用時，對耐VRC的白念珠菌（C.albicans10 060,FICI=0.033）表現(xiàn)出優(yōu)異的協(xié)同抗真菌活性 (表3)。

表2 Rocilinostat 與氟康唑單用或聯(lián)用對多種念珠菌菌株的體外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]

表3 Rocilinostat 與伏立康唑單用或聯(lián)用對白念珠菌菌株的體外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]

2.3 Rocilinostat 與氟康唑聯(lián)用有效抑制真菌的生長

為進(jìn)一步考察化合物Rocilinostat 的協(xié)同抗真菌活性，我們又開展了時間-生長曲線實驗。從圖3結(jié)果可以看出，高濃度的氟康唑或Rocilinostat 單獨(dú)使用對真菌生長無抑制作用，而Rocilinostat 與不同濃度的氟康唑聯(lián)用能夠有效抑制真菌的生長，且呈濃度依賴趨勢 (圖3 中抑制劑為Rocilinostat)。

圖3 化合物Rocilinostat 和氟康唑聯(lián)用對白念珠菌的生長抑制作用

2.4 Rocilinostat 對真菌細(xì)胞的選擇性作用

采用HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）對化合物Rocilinostat 進(jìn)行細(xì)胞毒性的評價。結(jié)果如表4 顯示，化合物Rocilinostat 對正常細(xì)胞表現(xiàn)出低毒性，IC50值為52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相當(dāng)于其發(fā)揮協(xié)同抗耐藥真菌（C.albicans0304103）活性MIC80值的44 倍，表明Rocilinostat 對真菌細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇性作用。此外，我們還測試了化合物Rocilinostat對真菌總HDAC 酶的抑制活性，結(jié)果表明，Rocilinostat對真菌HDAC 酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）優(yōu)于泛HDAC 抑制劑伏立諾他（IC50=1.03 μmol/L）。

表4 Rocilinostat 對正常細(xì)胞的毒性和真菌總HDAC 酶活性IC50 (μmol/L)

3 討論

本研究從市售的8 個HDAC 抑制劑中篩選出協(xié)同活性最佳的化合物Rocilinostat。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Rocilinostat 與氟康唑聯(lián)用對白念珠菌和光滑念珠菌具有協(xié)同增效作用。此外，化合物Rocilinostat與伏立康唑聯(lián)用對臨床分離的耐藥白念珠菌株同樣具有優(yōu)秀的抗真菌活性。更值得關(guān)注的是，化合物Rocilinostat 對正常細(xì)胞表現(xiàn)出低毒性，其對真菌細(xì)胞具有很好的選擇性。因此，HDAC 抑制劑Rocilinostat 可以作為一種低毒、有效的唑類抗真菌藥物增效劑，為抗真菌藥物的發(fā)展提供了新的研究基礎(chǔ)。