果馨儒，馬曉曉，蘭 卓，吳婷婷，邱陽元，金振華，李 燁，高忠燕，張顯光，王春仁*

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾161005；3.黑龍江扎龍自然保護區(qū)管理局，黑龍江齊齊哈爾161005)

前殖吸蟲(Prosthogonimusspp.)屬于前殖科(Prosthogonimidae)、前殖屬(Prosthogonimus)，主要寄生于禽類和鳥類的直腸、輸卵管、法氏囊和泄殖腔。禽和鳥類采食了含有囊蚴的蜻蜓及其稚蟲后感染，大量蟲體寄生不僅奪取宿主的營養(yǎng)，還會擾亂其正常生理功能，產生毒素造成機械性損傷，嚴重者還會造成腹膜炎引起死亡。前殖吸蟲病分布范圍很廣，亞洲、歐洲、北美洲都有報道；在我國的河北、山東、遼寧、四川、廣東和福建等省份均有發(fā)現(xiàn)，以華東、華南地區(qū)較為多見[1]。印度尼西亞報道了一名9個月嬰兒感染前殖吸蟲而引起前列腺炎的病例[2]。在某些地區(qū)，人們有吃蜻蜓和蜻蜓幼蟲的習慣[3]。因此，前殖吸蟲也可能是一種被忽視的潛在人獸共患動物病原。

目前對于前殖吸蟲的研究多見于流行病學、病例分析、治療及預防等方面，關于前殖吸蟲分子生物學的研究還比較少。對于楔形前殖吸蟲的核糖體序列，僅見核糖體大亞基(large subunit ribosomal DNA，28S)和內轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)的報道。核糖體DNA(ribosomal DNA，rDNA)是生物最保守的基因之一，各段基因廣泛應用于分類、進化、變異及遺傳等方面的研究[4]。真核生物的rDNA均是串聯(lián)的多拷貝序列組成，其組成包括核糖體小亞基(small subunit ribosomal DNA，18S)、內轉錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer 1，ITS1)、5.8S核糖體基因(5.8S ribosomal DNA，5.8S)、內轉錄間隔區(qū)2(internal transcribed spacer 2，ITS2)、核糖體大亞基(28S)以及基因間隔區(qū)(intergenic spacer,IGS)。Olson P D等[5]利用18S和28S作為分子標記，研究了77科163種吸蟲間的進化關系。Yan H等[6]利用完整的18S序列對7個帶絳蟲屬絳蟲的系統(tǒng)發(fā)育關系進行了研究，這些研究均證明18S是較好的基因標記。本研究對采自丹頂鶴的楔形前殖吸蟲核糖體全系列進行了測定，并利用18S序列構建進化樹以研究其系統(tǒng)進化關系，旨在為楔形前殖吸蟲分類、群體遺傳學和系統(tǒng)發(fā)育學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體的收集 所用的楔形前殖吸蟲成蟲采自黑龍江省扎龍自然保護區(qū)自然死亡丹頂鶴的泄殖腔。蟲體經生理鹽水洗凈，700 mL/L酒精固定備用。

1.1.2 主要試劑 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)，天根生化科技(北京)有限公司產品；Axygen DNA 凝膠回收試劑盒，康寧生命科技有限公司產品；2×TKSTaqbuffer,TKSTaq酶，寶生物工程(大連)有限公司產品；DNA標準DL 2 000、DNA標準DL 5 000，北京博邁德基因技術有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀，Takara Bio公司產品；電泳儀(DYY-6C)，北京君意東方電泳設備有限公司產品；紫外線凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司產品；恒溫水浴鍋(Hws24),上海恒科儀器有限公司產品；紫外儀(WD-9403C)，北京六一生物科技有限公司產品；臺式冷凍型微量離心機(D3024R)，美國塞洛捷克公司產品。

1.2 方法

1.2.1 蟲體基因組DNA提取及分子鑒定 蟲體經形態(tài)初步鑒定后，使用TIANGEN公司DNA提取試劑盒提取蟲體總基因組DNA，以NC5 (5'-GTAGGTGAACCTGCGGAACGATCATT-3') 和 NC2 (5'-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3') 引物擴增蟲體ITS2序列進行分子鑒定，剩余基因組DNA置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計 對GenBank上發(fā)表的斜睪目相關吸蟲的28S和ITS序列進行比對，尋找到保守區(qū)間，利用Primer 5.0設計引物。引物由哈爾濱擎科生物技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.3 rDNA擴增、測序與拼接 利用設計的引物對楔形前殖吸蟲核糖體全序列進行擴增，反應體系為25 μL，包括2×TKSTaqbuffer 12.5 μL、ddH2O 10 μL、上游引物(25 mol/L)0.5 μL、下游引物(25 mol/L)0.5 μL、模板DNA 1 μL、TKSTaq(5 U/μL)0.5 μL。

PCR反應條件為：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，53 ℃～57.2 ℃ (各段基因退火溫度見表1) 15 s和68 ℃ 30 s，35個循環(huán);68 ℃ 7 min。取PCR產物5 μL，加入0.5 μL的10×Loading buffer，混勻后于1 g/L瓊脂糖凝膠中100 V電壓下電泳25 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結果。利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒的純化方法進行陽性PCR產物純化，將純化后的產物送庫美生物進行雙向測序，將分段的序列通過DNA Star軟件進行拼接。

表1 楔形前殖吸蟲核糖體各部分引物序列Table 1 Primer sequences of various parts of ribosomal DNA of Prosthogonimus cuneatus

1.2.4 rDNA序列分析 將擴增的楔形前殖吸蟲核糖體序列與GenBank中的Brachycladiumgoliath(GenBank登錄號：KR703279.1)、胰闊盤吸蟲(KY490003.1)和卵圓前殖吸蟲(AY222149.1)利用Mega X進行比對，來確定各部分的長度和位置。使用DNA Star 5.0軟件計算楔形前殖吸蟲核糖體各部分的A+T含量。楔形前殖吸蟲核糖體全序列的正向和反向重復序列通過REPuter在線軟件(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)進行查找，最長和最短重復序列的長度分別設置為50 bp和10 bp，允許不匹配堿基個數(shù)設置為1。通過MegAlign軟件將楔形前殖吸蟲核糖體序列與同目吸蟲比較，進行同源性分析。

1.2.5 進化分析 用Mage X軟件與GenBank中23種代表性復殖吸蟲18S的核糖體序列進行比對，截齊序列。以土耳其斯坦裂體吸蟲(Schistosomaturkestanicum，AF442499.1)作外群，運用最大簡約法(Maximum parsimony methods,MP)、最大似然法(Maximum likelihood methods,ML)和貝葉斯法(Bayesian method，BI)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，探討其與其他吸蟲的進化關系。MP和ML采用PAUP*4.0 beta 10[7]軟件，分析中分別運行1 000次和100次自展法確定拓撲結構的可信度。BI使用MrBayes 3.1.1[8]軟件，采用MCMC模式運算，每100代為一組，運算1 000 000代，當分化頻率標準差小于0.01時進行Sumt分析。

2 結果

2.1 楔形前殖吸蟲的分子鑒定

PCR擴增后蟲體ITS2大小為224 bp，序列上傳NCBI(MT804376)。與來自捷克(KP192738.1)和印度(MG910996.1)的楔形前殖吸蟲ITS2序列同源性分別為100%和99.1%，故鑒定該蟲體為楔形前殖吸蟲。

2.2 楔形前殖吸蟲核糖體全序列PCR擴增結果

楔形前殖吸蟲的PCR擴增結果如圖1所示。18S-ITS1、ITS1-ITS2、ITS2-28S-1、28S-1-28S-2和28S-18S段的目的條帶分別約為1 900、2 000、2 000、1 500、3 000 bp，均與預期條帶大小相符。

A.18S-ITS1；B.ITS1-ITS2；C.ITS2-28S-1；D.28S-1-28S-2；E.28S-18S;M.DNA 標準;1～3.楔形前殖吸蟲樣本

2.3 核糖體全序列特征分析結果

楔形前吸蟲核糖體全序列長10 317 bp(已上傳GenBank，并獲得序列號為MW376724.1)。其中18S、ITS1、5.8S、ITS2、28S和IGS的序列長度分別為1 970、1 271、161、224、4 155、2 932 bp。核糖體全序列A+T含量為49.87%。

楔形前殖吸蟲18S序列A+T含量為49.95%，存在13對反向重復序列，長度較短，為10 bp～12 bp，沒有發(fā)現(xiàn)正向重復序列(表2)；與同目吸蟲比對發(fā)現(xiàn)長度變化為2 bp～23 bp，同源性為91.2%～93.6%。楔形前殖吸蟲ITS1序列A+T含量為50.75%，其中包含8對正向重復序列，長度為23 bp～94 bp，4對反向重復序列，長度為10 bp～11 bp。5.8S序列A+T含量為46.58%，未發(fā)現(xiàn)重復序列，與同目吸蟲比對長度無變化，同源性為96.2%～99.4%。ITS2序列A+T含量為50.00%，未發(fā)現(xiàn)重復序列，與NCBI現(xiàn)有的楔形前殖吸蟲的ITS2序列相比長度無變化，種內差異為0～0.9%，與透明前殖吸蟲ITS2差異為8.0%。28S序列A+T含量為48.33%，共發(fā)現(xiàn)21對反向重復序列，長度為10 bp～17 bp；與同目的吸蟲比對長度變化為9 bp～26 bp，同源性為83.8%～88.8%。IGS序列A+T含量為52.05%，其中包含7對正向重復序列，長度為30 bp～71 bp，17對反向重復序列，長度為10 bp～14 bp。在楔形前殖吸蟲核糖體全序列中，共出現(xiàn)正向重序列15對，反向重復序列34對，其重復類型、大小、數(shù)量、起始位置及所在基因結果見表2。

表2 楔形前殖吸蟲核糖體全序列重復序列

2.4 進化分析結果

基于核糖體18S序列采取BI、ML和MP三種方法構建的進化樹結果基本一致。所有吸蟲分成兩大分支，其中棘口目和Pronocephalata形成了一個分支，Xiphidiata與后睪目形成了另一分支。本研究中的楔形前殖吸蟲與同屬的卵圓前殖吸蟲和同科稀有裂睪吸蟲聚集在一起，并與Brachycoeliumsalamandrae和Auridistomumchelydrae形成姊妹分支，然后再與Xiphidiata目其他科聚集形成一個獨立分支(圖2)。

圖2 基于核糖體18S序列構建的遺傳進化關系

3 討論

楔形前殖吸蟲核糖體基因排列與其他吸蟲(如東方次睪吸蟲和華支睪吸蟲[9])一致，全長為10 317 bp，較其他復殖吸蟲要長，如B.goliath(9 297 bp)、胰闊盤吸蟲(8 493 bp)和華支睪吸蟲(8 049 bp)[9-11]。研究表明，斜睪目、棘口目和后睪目18S的A+T含量都在50.00%以下，而梟形目18S的A+T含量在50.05%～51.09%之間[11]，本研究中18S序列的A+T含量為49.95%，較其他吸蟲高但低于梟形目。18S有13對反向重復序列，沒有正向重復序列，這與華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲相似[9]。與日本棘隙吸蟲和卷棘口吸蟲18S部分序列(AY222132，LT904764)比對同源性分別為91.2%和91.4%。楔形前殖吸蟲核糖體28S的長度為4 155 bp，與鹿前后盤吸蟲(4 186 bp)和B.goliath(4 182 bp)相似[10,12]。在28S中發(fā)現(xiàn)反向重復序列較18S的重復序列多，有研究發(fā)現(xiàn)28S較18S變異更大，更適用于種到科水平的研究[9]，我們在同目的比對中也同樣發(fā)現(xiàn)28S較18S同源性更低，這種現(xiàn)象可能與重復序列數(shù)量的多少有關。本研究中丹頂鶴體內的楔形前殖吸蟲與來自烏克蘭的紫翅椋鳥體內的楔形前殖吸蟲28S部分序列(AY220634)相比同源性為95.1%，在A+T含量上丹頂鶴體內的楔形前殖吸蟲的較紫翅椋鳥體內的46.14%要高。與日本棘隙吸蟲、舟形嗜氣管吸蟲、螯形棘隙吸蟲、似錐低頸吸蟲、卷棘口吸蟲、宮川棘口吸蟲28S部分序列(JQ890582、MK327367、KT956931、KP065607、KP065605、KT956916)截齊比對后發(fā)現(xiàn)同源性分別為82.1%、81.3%、82.8%、82.6%、82.8%和82.9%。楔形前殖吸蟲的5.8S長度和A+T含量與其他復殖吸蟲相似，且沒有發(fā)現(xiàn)重復序列，與同目的吸蟲比對后發(fā)現(xiàn)差異僅為0～4.8%，較其他段保守。與似錐低頸吸蟲和卷棘口吸蟲5.8S(MT127131，MN874065)比對同源性均為98.1%。之前的研究也同樣證明了5.8S在核糖體序列中最為保守，但是由于其長度較短，很少應用于分子系統(tǒng)發(fā)生研究[11]。

楔形前殖吸蟲的ITS2長度為224 bp，較其他復殖吸蟲短，如曼氏血吸蟲(311 bp，AY446081)和卷棘口吸蟲(428 bp，U58102)。本研究中丹頂鶴體內的楔形前殖吸蟲ITS2序列與來自越南中部的綠頭鴨體內的楔形前殖吸蟲ITS2(MG910996)同源性為99.1%，在A+T含量上二者僅相差0.45%。本研究中丹頂鶴體內的楔形前殖吸蟲ITS2序列與來自中東地區(qū)的綠頭鴨體內的烏鶇楔形前殖吸蟲ITS2(KP192738)同源性為100%，序列長度和A+T含量均一致。與宮川棘口吸蟲、卷棘口吸蟲、日本棘隙吸蟲、似錐低頸吸蟲的ITS2序列(MH796365、MN874065、KT873313、KJ944311)比對同源性分別為64.3%、64.2%、60.3%和62.7%。以上結果表明，不同地域來源的楔形前殖吸蟲的ITS2同源性差異極小。然而，楔形前殖吸蟲與透明前殖吸蟲的差異為8.0%(KP192734.1)，種間存在較大的差異，因此，ITS2是蟲種間分子鑒定的最適宜基因標記。本研究中ITS1長度(1 217 bp)與同目的胰闊盤吸蟲相似，較其他吸蟲較長，如園圃棘口吸蟲(443 bp，U58101)和衛(wèi)氏并殖吸蟲(624 bp，AF040935)。ITS1的A+T含量較高，在50.75%以上，與胰闊盤吸蟲和梟形目的吸蟲相似[11]。在ITS1中發(fā)現(xiàn)了大量的正向和反向序列，這與Qiu Y Y等[9]和Zheng X等[12]的研究結果一致 。另外，Zheng X等[12]認為ITS1長度與重復序列的長短和數(shù)量相關。本研究ITS1序列中正向重復序列的長度普遍偏長，且ITS1長度也較長，因此，有理由相信ITS1長度與重復序列存在一定的關系。目前復殖吸蟲IGS全序列較少，由于IGS結構復雜，且進化速度較快，重復序列種類和數(shù)量多，即使在同種間，其長度和同源性的變化都較大，如鹿前后盤吸蟲IGS種內長度變化為577 bp～2 305 bp，同源性為0.2%～46.3%，東方次睪吸蟲IGS種內的長度變化為957 bp～2 530 bp，同源性為0.4%～43%[9,12]，日本分體吸蟲IGS種內的長度變化為1 252 bp～1 838 bp，同源性為0.1%～7.1%[13]。本研究中IGS的長度為2 932 bp，較以上蟲體要長，但因本研究只擴增了1條蟲體，希望以后再擴增更多的蟲體來研究楔形前殖吸蟲IGS是否存在多態(tài)性。Qiu Y Y等[9]采用IGS對華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲進行進化分析發(fā)現(xiàn)，IGS可能可以作為新的遺傳標記。有研究表明，DNA的GC含量越高，分子結構越穩(wěn)定[14]，因此對于AT含量較高的ITS1和IGS，其穩(wěn)定性較其他幾個區(qū)域要低。研究表明，重復序列中包含了大量的遺傳信息，從而調控基因的復制、轉錄和翻譯，還能特異性的結合蛋白質，從而使序列形成二級、三級甚至更高級結構。一般認為，簡單重復序列由于在DNA復制過程中的滑動容易出現(xiàn)變異，所以重復序列較多的IGS其變異性更大[15]。由于GenBank中的IGS全序列較少，且長度差異較大，以其作為基因標記進行進化關系的研究還非常少，希望擴增更多的吸蟲IGS序列，進一步來探討其作為基因標記研究進化的可能性。在與家禽感染的其他吸蟲核糖體各段比對中發(fā)現(xiàn)同源性由高到低為5.8S>18S>28S>ITS2，由于這些蟲體核糖體全序列還未見報道，因此無法與全序列進行比較分析，希望以后對這些吸蟲再進行深入的探討。

基于18S構建的系統(tǒng)進化樹顯示，楔形前殖吸蟲與卵圓前殖吸蟲、稀有裂睪吸蟲處于同一分支，這與Heneberg P等利用線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，cox1)和NADH脫氫酶亞基1(NADH dehydrogenase subunit 1，nad1)構建進化樹的結果一致，值得注意的是在我們的研究同樣顯示了楔形前殖吸蟲和卵圓前殖吸蟲雖為同屬，但卵圓前殖吸蟲卻與不同屬的稀有裂睪吸蟲聚集在一起。Heneberg P等[1]在對來自歐洲的前殖科進行分類研究時，認為裂睪屬應為前殖屬的同物異名，稀有裂睪吸蟲應為稀有前殖吸蟲，本研究的進化分析結果也支持他們的觀點。我們的研究結果與Olson P D等[5]采用核糖體18S+28S rDNA對復殖吸蟲構建系統(tǒng)進化樹的結果一致，他們同樣發(fā)現(xiàn)在Xiphidiata中，前殖科較其他科與Brachycoeliidae和Auridistomidae的親緣關系更近。由于吸蟲核糖體其他各段序列擴增的不多，且多數(shù)為部分序列，因此希望在未來的研究中，能擴增更多的核糖體序列，為吸蟲的分類研究提供基礎資料。

綜上所述，本研究首次測定了楔形前殖吸蟲的核糖體全序列，對其核糖體各段序列的特征進行了分析，探究了與其他吸蟲的系統(tǒng)發(fā)育關系，可為前殖科吸蟲的分子分類、群體遺傳和進化分析研究提供參考。