楊 潔，蔣 威，沈文祥，李亞娟，馬曉宇，王勝義，李宏勝，丁學(xué)智，武小虎，嚴(yán)作廷

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物重點實驗室，甘肅蘭州 730050)

乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)是一種革蘭氏陽性球菌，兼性厭氧，營養(yǎng)要求較高，在含有綿羊血的瓊脂培養(yǎng)基上生長良好。乳房鏈球菌通常是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原菌[1-2]，但也有研究表明乳房鏈球菌同樣可以導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生[3]。而國內(nèi)關(guān)于子宮內(nèi)膜炎的乳房鏈球菌報道還較少。子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后常見疾病之一，常造成奶牛受孕期延長，屢配不孕，甚至淘汰，帶來了巨大的經(jīng)濟損失[4]。乳房鏈球菌分離株通常攜帶有一些已知的毒力基因，如編碼透明質(zhì)酸莢膜的基因hasA、hasB、hasC，纖溶酶原激活物編碼基因pauA、GAPDH脫氫酶編碼基因gapC、乳鐵蛋白黏附基因sua，CAMP因子編碼基因cfu，以及黏附相關(guān)基因acdA、fpb和slp等，在細(xì)菌對宿主的黏附定植，組織損傷，以及逃避宿主免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[5]。生物被膜是包括乳房鏈球菌在內(nèi)很多細(xì)菌都具有的一種特性，能夠促進(jìn)細(xì)菌對組織的黏附，并幫助細(xì)菌抵抗外界不良環(huán)境[5]。對于奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療，臨床上常以抗菌藥物為主。但由于近年來抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致臨床分離株的耐藥性逐漸嚴(yán)重，使得抗菌藥物的治療效果明顯降低。對病原菌進(jìn)行藥敏試驗以此監(jiān)測病原菌耐藥情況，對于指導(dǎo)臨床合理用藥，提示新藥研發(fā)方向等具有重要意義。本研究通過采集甘肅省內(nèi)不同養(yǎng)殖場患有子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮黏液樣本，對病原微生物進(jìn)行分離鑒定，并對乳房鏈球菌的毒力基因、耐藥性以及生物被膜形成能力進(jìn)行檢測，以此來了解乳房鏈球菌導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎的致病機制及耐藥性情況，以期為奶牛子宮內(nèi)膜炎的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 血平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，OMEGA BIOTEC公司產(chǎn)品；2×TaqSuper Master Mix，北京諾禾致源科技股份有限公司產(chǎn)品；DNA Marker、核酸染料，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；引物，北京擎科生物技術(shù)有限公司合成；CAMHB 培養(yǎng)基，北京酷來搏科技有限公司產(chǎn)品；無菌裂解馬血，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 DNA凝膠成像系統(tǒng)，中國香港基因有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國博騰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 菌株來源 本研究的18株乳房鏈球菌分離自甘肅省武威市、張掖市5個牧場中子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮黏液樣品，如表1所示。

表1 乳房鏈球菌來源及分離率

1.2 方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜炎臨床診斷及采樣方法 奶牛分娩后21 d及以上，雖沒有明顯的全身性癥狀，但仍然分泌含有50%以上黏膿性物質(zhì)的子宮黏液時可被診斷為子宮內(nèi)膜炎[4]。采樣方法為將套有無菌輸精槍管套的輸精槍從陰道口插入子宮，用10 mL的注射器將子宮黏液吸出，然后注入細(xì)菌采樣管中低溫帶回實驗室。

1.2.2 乳房鏈球菌分離鑒定及CAMP試驗 將子宮黏液接種于血平板上，37 ℃有氧培養(yǎng)24 h，選取具有乳房鏈球菌典型生長特征的菌落進(jìn)行傳代純培養(yǎng)。使用基因組DNA提取試劑盒根據(jù)說明書的方法步驟提取細(xì)菌基因組DNA，并利用PCR擴增16S rRNA基因。引物序列及退火溫度如表2所示。PCR體系為25 μL： 12.5 μL 2×TaqSuper Master Mix，0.5 μL上游引物和下游引物(濃度為10 μmol/L)，300 ng DNA模板，剩余體積用去離子水補齊，并使用去離子水代替模板作為陰性對照。將PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L～20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送生物公司進(jìn)行核酸序列分析，并利用NCBI網(wǎng)站中的Blast程序比對結(jié)果 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，確定分離株的屬和種，并根據(jù)18株分離株及1株乳房鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(JCM 5709)的16S rRNA序列，運用MEGA-X軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹。CAMP試驗是指部分鏈球菌菌株可以分泌一種CAMP因子使得葡萄球菌β溶血帶增加，稱為協(xié)同溶血作用。試驗方法為將待測菌株劃一細(xì)線接種到血平板上，再用1株β溶血的葡萄球菌接種1條與剛才互相垂直的線條，注意兩條線距離0.5 mm左右，不要交叉，培養(yǎng)24 h后兩條線交匯處出現(xiàn)明顯的月牙形溶血現(xiàn)象可判定為CAMP試驗陽性菌。

1.2.3 乳房鏈球菌毒力基因檢測 檢測乳房鏈球菌分離株10種已知的毒力基因(hasA、hasB、hasC、sua、slp、pauA、gapC、acdA、fpb、cfu)。如上所述，提取乳房鏈球菌基因組DNA，使用特異性引物對毒力基因進(jìn)行擴增，表2列出了引物序列和退火溫度，PCR體系如上述所示，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳及拍照。

表2 引物序列及退火溫度

1.2.4 乳房鏈球菌生物被膜形成能力檢測 參考文獻(xiàn)[13]，運用組織培養(yǎng)平板法研究乳房鏈球菌分離株形成生物被膜的能力。將生長至對數(shù)期的細(xì)菌懸液濃度調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫?(108CFU/mL)，并用BHI肉湯(添加有20 mg/mL葡萄糖、20 mg/mL蔗糖和50 mL/L新生牛血清)100倍稀釋，稀釋后加入200 μL于96孔板中，每株菌重復(fù)3個孔。陽性對照為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 25923)，陰性對照為不含細(xì)菌的BHI肉湯。37 ℃培養(yǎng)36 h后，輕輕倒去液體，并用300 μL PBS沖洗3次，室溫晾干。甲醇固定20 min，20 mg/mL結(jié)晶紫染色15 min。將多余的結(jié)晶紫洗凈風(fēng)干后， 950 mL/L乙醇洗脫染料，用酶標(biāo)儀測量570 nm處吸光度值(OD)。每次試驗重復(fù)3次。判定標(biāo)準(zhǔn)ODc=平均值(陰性對照)+3SD(陰性對照)，若測量菌株的OD≤ODc，表示菌株不能產(chǎn)生生物膜；ODc≤OD≤2ODc，表示產(chǎn)生生物被膜的能力較弱；2ODc≤OD≤4ODc，表示產(chǎn)生生物被膜的能力為中等；OD>4ODc產(chǎn)生生物被膜的能力較強。

1.2.5 乳房鏈球菌耐藥性檢測 根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)指南，采用微肉湯稀釋法測定8種抗菌藥物對乳房鏈球菌分離株的最小抑菌濃度(MIC)。使用的抗菌藥物為氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、利福平、克林霉素、頭孢噻呋、慶大霉素。所用的培養(yǎng)基為含有50 mL/L無菌裂解馬血的CAMHB肉湯。在96孔板中使用培養(yǎng)基對抗菌藥物溶液進(jìn)行梯度稀釋，并加入細(xì)菌懸浮液(終濃度約為105CFU/mL)，總體積為200 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以肉眼無可見菌落形成的最小濃度作為該抗菌藥物對乳房鏈球菌的最小抑菌濃度。肺炎鏈球菌ATCC 49619為質(zhì)控菌株。根據(jù)CLSI指導(dǎo)手冊及之前的研究，8種抗菌藥物的耐藥臨界值見表3，其中紅霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、利福平、克林霉素、氨芐西林的臨界值均來源于CLSI指導(dǎo)手冊，頭孢噻呋及慶大霉素的臨界值參考文獻(xiàn)[11-12]。

表3 各抗菌藥物臨界值

2 結(jié)果

2.1 乳房鏈球菌分離率

本實驗從5個牧場的48份子宮黏液樣品中共計分離出18株(38.5%)乳房鏈球菌，結(jié)果見表4。不同牧場分離率介于0～57.14%之間，其中張掖市牧場3的分離率最高。18株分離株以及1株乳房鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。此外，CAMP試驗陽性菌為7株(38.89%)。

圖1 18株乳房鏈球菌分離株與1株乳房鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株系統(tǒng)進(jìn)化樹

表4 乳房鏈球菌毒力基因譜

2.2 乳房鏈球菌毒力基因檢測

所有分離株均攜帶pauA、fpb、sua、slp、gapC及cfu基因，而基因hasA、hasB、acdA的攜帶率分別為88.89%、94.44%和94.44%，未檢測到hasC基因。根據(jù)菌株攜帶的毒力基因種類，乳房鏈球菌的毒力基因譜有4類，如表5所示，其中最常見的類型為hasA/hasB/pauA/fpb/sua/slp/gapC/acdA/cuf。

表5 乳房鏈球菌毒力基因譜

2.3 乳房鏈球菌生物被膜形成能力

所有的乳房鏈球菌分離株都具有形成生物被膜的能力，其中33.3%(n=6)的菌株具有較強的生物被膜形成能力，而27.8%(n=5)及38.9%(n=7)的菌株分別具有中等強度及較弱的生物被膜形成能力。

2.4 乳房鏈球菌耐藥性

乳房鏈球菌對8種抗菌藥物的耐藥性比例見表6。18株乳房鏈球菌對利福平敏感且MIC值均小于等于0.125 μg/mL。14株(77.8%)分別對四環(huán)素和克林霉素耐藥，MIC值為0.125 μg/mL～16 μg/mL和0.125 μg/mL～4 μg/mL。11株(61.1%)和14株(77.8%)分別對紅霉素和左氧氟沙星敏感，MIC值為0.063 μg/mL～4 μg/mL和0.25 μg/mL～32μg/mL。77.8%的菌株對氨芐西林敏感，剩余22.2%的菌株對氨芐西林中度敏感，MIC范圍為0.016 μg/mL～8 μg/mL。12株(66.7%)，13株(72.2%)分別對頭孢噻呋及慶大霉素耐藥，MIC范圍為0.031 μg/mL～ 4 μg/mL及0.25 μg/mL～32μg/mL。

表6 18株乳房鏈球菌對8種抗菌藥物的耐藥性

3 討論

乳房鏈球菌作為一種環(huán)境性病原微生物，能夠適應(yīng)不同的環(huán)境條件及宿主。乳房鏈球菌最初是在患有奶牛乳房炎的乳汁中分離得到的，而此后的一些研究發(fā)現(xiàn)，乳房鏈球菌同樣可以從產(chǎn)后奶牛的子宮黏液中分離得到，成為導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的潛在威脅[3]。由于奶牛生產(chǎn)過程中子宮頸口打開，使得原本定植于生殖道的正常菌群或存在于環(huán)境中的微生物逆行進(jìn)入子宮，并在子宮內(nèi)定植且大量繁殖，引起產(chǎn)后急性炎癥，大部分奶牛通過自凈作用可以在產(chǎn)后21 d之內(nèi)將病原微生物排出體外，恢復(fù)子宮內(nèi)無菌環(huán)境。但部分無法將病原菌自行排出體外的奶牛，將可能患上產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎，導(dǎo)致受孕延遲，影響生產(chǎn)性能。

通過對德國某牧場產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)微生物的動態(tài)學(xué)分析表明，乳房鏈球菌的分離率為18.5%[3]。但國內(nèi)對來源于子宮內(nèi)膜炎的乳房鏈球菌的研究還較少，本研究的結(jié)果表明，來自張掖及武威的子宮黏液樣品乳房鏈球菌的分離率分別為43.59%及11.11%，說明不同地區(qū)不同牧場導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎的優(yōu)勢病原菌的種類存在一定的差異。

乳房鏈球菌攜帶有一些已知的毒力基因，在細(xì)菌黏附、定植、組織損傷及逃避宿主免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮著重要作用。hasA、hasB和hasC基因編碼透明質(zhì)酸莢膜，可以封閉中性粒細(xì)胞表面受體的Fc位點，防止菌體與中性粒細(xì)胞結(jié)合，從而抵抗中性粒細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬作用，逃避宿主的免疫應(yīng)答。不過，有研究表明，has基因缺陷株同樣可以抵抗中性粒細(xì)胞的殺菌作用而引發(fā)奶牛乳房炎[6]。本試驗中hasA和hasB基因的攜帶率分別為88.89%和94.44%，沒有檢測到hasC基因。而在國外的一些研究中，例如在阿根廷某些牧場中患有乳房炎奶牛分離得到的乳房鏈球菌，hasA，hasB及hasC的攜帶率分別為74.3%、66.4%和89.7%[7]。PauA基因編碼纖溶酶原激活物，可以將纖溶酶原激活為纖溶酶，水解宿主細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及上皮細(xì)胞緊密連接蛋白，促進(jìn)細(xì)菌的定植及擴散[5]。本研究中，pauA基因存在于100%的菌株中。因此，有研究用pauA基因作為普通RCR診斷方法以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)診斷方法的分子靶標(biāo)，為臨床乳房鏈球菌的快速檢測提供了便利[14-15]。GapC基因編碼的是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，可以將甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1，3-雙磷酸甘油酸，參與糖酵解過程。在本試驗中，100%的乳房鏈球菌攜帶有g(shù)apC基因。而在阿根廷某些牧場來源于乳房炎的乳房鏈球菌中，gapC基因的檢出率為79.4%[7]。有研究利用GapC重組蛋白對小鼠進(jìn)行免疫，保護(hù)率可達(dá)到70%，表明GapC蛋白可作為預(yù)防乳房鏈球菌感染疫苗研發(fā)的候選蛋白[16]。SUAM是一種能夠結(jié)合乳鐵蛋白的黏附分子，由sua基因編碼。在本研究中，sua基因的攜帶率為100%，而在上述阿根廷某些牧場分離得到的菌株中，sua基因的攜帶率為83.3%[7]。cfu基因編碼CAMP因子，可以增強β溶血型金黃色葡萄的溶血活性，在混合感染中發(fā)揮作用。在本試驗中，所有的乳房鏈球菌均攜帶有cfu基因，但僅38.89%的菌株表現(xiàn)為CAMP試驗陽性。而在上述分離自奶牛乳房炎的菌株中，cfu基因的攜帶率為76.9%， CAMP試驗陽性的菌株為23%[7]，表明并不是所有攜帶有cfu基因的菌株都表現(xiàn)CAMP試驗陽性。還有一些與黏附相關(guān)的編碼基因，如acdA基因編碼的是一種Zn結(jié)合蛋白，94.44%的分離株攜帶有該基因，slp基因編碼的是一種表面脂蛋白，本試驗分離得到的菌株都有攜帶，fpb編碼的是一種經(jīng)分選酶加工的表面蛋白，攜帶率同樣為100%。

細(xì)菌可以分泌一些胞外多聚物如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等，形成一種致密的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)菌由懸浮態(tài)變?yōu)轲じ綉B(tài)，稱為生物被膜。本試驗的結(jié)果表明，100%的乳房鏈球菌具有形成生物被膜的能力，其中33.3%的菌株具有較強的生物被膜形成能力。而在國外的一些研究中，來源于德國及波蘭牧場乳房炎的乳房鏈球菌中，大約有46%～77%的菌株能夠形成生物被膜[12,17]。

抗菌藥物仍然是治療奶牛子宮疾病的主要方法，但由于近年來抗菌藥物的不合理使用，使得臨床分離株的耐藥性日益嚴(yán)重。且一旦針對某抗菌藥物的耐藥菌株形成，該菌株攜帶的基因可在不同種屬的菌群中擴散，使得耐藥情況更加嚴(yán)峻。因此,根據(jù)藥敏試驗結(jié)果合理使用抗菌藥物，避免抗菌藥物的濫用及泛用就顯得尤為重要。本試驗測定了8種抗菌藥物對乳房鏈球菌的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果表明，乳房鏈球菌對四環(huán)素、克林霉素、頭孢噻呋、慶大霉素的耐藥性較嚴(yán)重，分別達(dá)到了77.8%、77.8%、66.7%及72.2%。大部分的菌株對紅霉素、左氧氟沙星及氨芐西林敏感，分別為61.1%、77.8%和77.8%。但部分菌株對這3種抗菌藥物耐藥，因此需要進(jìn)一步了解乳房鏈球菌對這些抗菌藥物耐藥機制，警惕耐藥菌株在菌群中的擴散。在此前對巴西某牧場臨床乳房炎的乳房鏈球菌研究中，該地區(qū)菌株對氨芐西林的耐藥性較嚴(yán)重，達(dá)到了66.2%，頭孢噻呋、四環(huán)素及紅霉素的結(jié)果與本試驗差異不大，對頭孢噻呋、四環(huán)素耐藥菌株達(dá)77.1%和69.9%，且有53.1%的菌株對紅霉素敏感[18]。在2015年-2016年對歐洲乳房炎的調(diào)查表明大部分的乳房鏈球菌對氨芐西林敏感，有24%和37.5%的菌株分別對紅霉素及四環(huán)素耐藥[19]。

本試驗表明，張掖地區(qū)子宮內(nèi)膜炎病例中乳房鏈球菌的分離率較高，可能成為引起子宮內(nèi)膜炎的優(yōu)勢菌群。此外，來源于子宮內(nèi)膜炎的乳房鏈球菌同樣攜帶有多種已知的毒力基因，且都具有形成生物被膜的能力。該地區(qū)乳房鏈球菌對四環(huán)素、克林霉素、頭孢噻呋、慶大霉素的耐藥性較嚴(yán)重，對紅霉素、左氧氟沙星及氨芐西林的較為敏感。