馬文斌,王 萌,潘陽陽,王靖雷,張燕燕,高麗青,張 暉,王軍乾,余四九,王立斌

(甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，甘肅蘭州 730070)

胞外焦磷酸酶/磷酸酯酶2(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2，ENPP2)又稱自分泌趨化因子(autotaxin，ATX)[1]。它由2個N-末端生長激素B樣結構域(SMB1和SMB2)、1個中心催化磷酸二酯酶(PDE)結構域和1個C-末端核酸酶樣結構域(NUC)組成[2]，是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases，ENPPs)家族中的1種，該家族中只有ENPP2具有溶血磷脂酶D(lysoPLD)活性，能以溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)為底物催化生成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)[3]。LPA是一種胞外信號分子，其通過與6種不同的G蛋白偶聯(lián)受體(LPA1-6)結合發(fā)出信號，這些受體存在于許多不同類型的細胞表面，連接多個下游信號通路[3]。在生物體內發(fā)揮著重要作用，如參與細胞增殖、分化和凋亡等許多生理和病理的過程[4]。ENPP2最早是從人黑色素細胞中分離得到的[5]，目前已經證實Enpp2基因在生物體內廣泛表達，比如在腦、胎盤和卵巢中都能檢測其mRNA的表達。據(jù)報道，敲除Enpp2基因后，小鼠在胚胎發(fā)育的第9.5天死亡，并證實其在卵黃囊血管形成中發(fā)揮重要作用。Ahn H J等[7]檢測了大鼠子宮中ENPP2的表達，結果顯示在不同發(fā)情周期ENPP2的表達量不同；進一步研究發(fā)現(xiàn)在小鼠子宮中ENPP2的表達受到雌激素的調控。Seo H等[8]發(fā)現(xiàn)在豬發(fā)情周期和妊娠期所有階段的子宮內膜中均檢測到ENPP2的表達，并證明ENPP2可能調節(jié)LPA的合成，在豬妊娠過程中的建立中發(fā)揮著重要作用。Sinderewicz E等[9]研究證明ENPP2在牛卵泡生長發(fā)育中具有重要的調節(jié)作用。

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高海拔的一種特有畜種，對牧區(qū)人們的生活起著非常重要的作用，其低繁育率的問題大大地影響了當?shù)亟洕陌l(fā)展，也一直以來受到人們的關注。目前，國內外尚無關于ENPP2在牦牛生殖器官中表達和定位的報道。為了探明ENPP2對牦牛生殖活動的調節(jié)作用，本研究擬克隆Enpp2基因，并通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白質免疫印跡(Western blot)和免疫組織化學法檢測ENPP2在牦牛不同繁殖階段卵巢、輸卵管和子宮中的表達與定位，為進一步探究ENPP2在調節(jié)牦牛生殖生理活動中發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 樣品采集 選取健康雌性牦牛，年齡4歲～8歲，處于卵泡期(卵巢上有優(yōu)勢卵泡)、黃體期(卵巢上有明顯黃體)和妊娠期的牦牛各3頭，頸動脈放血處死后，采集卵巢、輸卵管和子宮樣品。一部分用錫箔包住后放入-196 ℃液氮中保存，用于RT-qPCR、Western blot和基因克隆試驗；另一部分放入含40 mg/mL多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組化試驗。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉錄 提取牦牛卵巢、輸卵管和子宮的總RNA，并反轉錄合成cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計 在GenBank上參考基因序列，牛(Bostaurus)登錄號：NM-001080293.1，設計引物。引物序列、退火溫度和產物長度等見表1。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 目的基因及內參基因引物序列

1.2.3 基因克隆 PCR的反應體系為：Taq酶10 μL，模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應條件為：94 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，62.3 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s(擴增)，共45個循環(huán)；72 ℃ 5 min。產物回收DNA序列，與 pMDTM19-TVector載體連接構建重組質粒，轉化至JM109感受態(tài)細胞中，加入SOC培養(yǎng)基，37 ℃180 r/min恒溫振蕩1 h，取120 μL涂于含有Amp、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)。挑取陽性克隆菌放入有Amp的液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜，將菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析 利用NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析牦牛Enpp2基因同源性；利用MEGA7.0軟件鄰域聯(lián)結法繪制系統(tǒng)進化樹；利用NCBI在線軟件Open reading frame finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)進行開放閱讀框分析；利用在線軟件ExPASy Protparam (https://web.expasy.org/protparam)分析理化性質；利用PSIPRED在線軟件(http:bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預測ENPP2蛋白的二級結構；利用軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.ex-pasy.org)預測ENPP2蛋白三級結構；利用在線軟件Prots Cale (https://web.expasy.org/protscale)分析蛋白親疏水性；利用在線軟件TMHMMServerV2.0 (http:www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測蛋白跨膜區(qū)域；利用在線軟件Netphos預測磷酸化位點(http:www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)。

1.2.6 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的表達

1.2.6.1 總蛋白的提取及變性 低溫研磨組織后加入蛋白裂解液，待組織充分裂解后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液與上樣緩沖液(4×)按3∶1混合，100 ℃變性10 min，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的表達 使用60 g/L的分離膠和120 g/L的濃縮膠，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，切出目的條帶(115 ku)和內參條帶(42 ku)，用0.45 mm PDVF膜轉膜，PBST溶液沖洗，50 mg/mL脫脂奶粉4 ℃封閉8h，PBST沖洗。一抗(1∶500)孵育，4 ℃過夜，PBST溶液洗3次，每次10 min：二抗(1∶1 000)搖床37 ℃孵育60 min，PBST溶液沖洗6次，每次10 min。在PDVF膜上滴加ECL化學發(fā)光液，避光1 min，在發(fā)光儀下掃描PDVF膜，ImageJ分析圖像，根據(jù)灰度值分析ENPP2的表達量。

1.2.7 ENPP2在牦牛生殖器官中的定位 制作牦牛生殖器官組織切片，烘片6 h，脫蠟，在檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復；滴加30 mL/L的過氧化氫溶液，37 ℃孵育 10 min，PBS溶液洗3次每次3 min；滴加封閉液(A液)，37 ℃孵育15 min，滴加一抗 (1∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜，陰性對照加 PBS替代一抗，PBS溶液洗3次，每次3 min；滴加二抗(B 液)，37 ℃孵育15 min，PBS溶液洗3次，每次3 min；滴加C液，37 ℃孵育 15 min；加DAB顯色液避光顯色；復染、脫水、透明、封片，顯微鏡(DP71，日本Olympus) 拍照。

2 結果

2.1 牦牛 Enpp2 基因克隆

牦牛Enpp2基因的擴增條帶見圖1，連接載體測序后與參考序列(NM-001080293.1)相似度為99%。測序結果已提交至NCBI GenBank，基因登錄號為MW030285。

M.DNA 標準DL 5 000;1.卵巢；2.輸卵管；3.子宮

2.2 生物信息學分析

2.2.1Enpp2基因系統(tǒng)進化樹構建 在NCBI Blast比對同源性結果顯示，牦牛(Bosgrunniens)MW030285與牛 (Bostaurus) NM-001080293.1、水牛 (Bubalusbubalis) XM-006074703.2、綿羊(Ovisaries) XM-004011866.4、白鰭豚 (Lipotesvexillifer) XM-007451670.1、駱駝 (Camelusdromedarius) XM-031439546.1、馬(Equuscaballus) XM-003365623.4、澳洲野犬(Canislupusdingo) XM-035718429.1和狐獴 (Suricatasuricatta) XM-029923366.1的同源性分別為99.03%、97.90%、96.41%、91.86%、90.98%、90.36%、90.03%和89.95% 。使用軟件MEGA 7.0 構建牦牛Enpp2基因系統(tǒng)進化樹(圖2)。

圖2 牦牛Enpp2基因系統(tǒng)進化樹(★表示本試驗克隆)

2.2.2Enpp2開放閱讀框分析及基因編碼蛋白的理化性質分析 經NCBI在線軟件ORF finder分析表明，Enpp2基因ORF全長2 669 bp，總共編碼875個氨基酸，分子質量為100 093.77 u，分子式為C4 469H6 832N1 224O1 301S49，理論等電點為是7.14，含20種氨基酸，亮氨酸含量最多(8%)，色氨酸含量最少(1.4%)。帶負電荷殘基總數(shù)108個，帶正電荷殘基總數(shù)107個。該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為56.80，為不穩(wěn)定蛋白。

2.2.3Enpp2基因編碼蛋白的信號肽、磷酸化位點、疏水性及跨膜結構域分析 根據(jù)在線軟件Prots Cale預測Enpp2基因編碼蛋白疏水性結果表明，位于16位的苯丙氨酸疏水性最強，位于827位的天冬氨酸親水性最強；結果顯示該蛋白氨基酸親水性大于疏水性，為可溶性蛋白。根據(jù)在線軟件SignalP-5.0 Server預測Enpp2編碼蛋白信號肽，證明該蛋白有信號肽，信號肽含量為69.67%。TMHMM Server V 2.0 軟件分析顯示牦牛ENPP2蛋白有跨膜螺旋，為跨膜蛋白。利用在線軟件Netphos預測ENPP2蛋白磷酸化位點分析結果顯示，有38個絲氨酸、28個蘇氨酸和 12個酪氨酸磷酸化位點大于閾值0.5，可以稱為蛋白質激酶磷酸化位點，總共78個磷酸化位點。

2.2.4Enpp2基因編碼的蛋白高級結構預測 由在線軟件PSIPRED預測牦牛ENPP2蛋白的二級結構如圖3所示。在線軟件SWISS-MODEL預測ENPP2蛋白的三級結構如圖4所示。

圖3 牦牛Enpp2基因編碼蛋白二級結構預測

圖4 牦牛Enpp2基因編碼蛋白三級結構預測

2.3 Enpp2基因在牦牛生殖器官中的表達

Enpp2基因在牦牛生殖器官中均有表達(圖5)。在卵巢中，妊娠期Enpp2基因的相對表達量明顯高于卵泡期和黃體期；在輸卵管中，其相對表達量在黃體期最高，卵泡期次之，妊娠期最低；在子宮中，妊娠期的相對表達量有明顯低于卵泡期和黃體期。

A.卵巢；B.輸卵管;C.子宮;不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05A.Ovary；B.Oviduct；C.Uterus;Different lowercase letters mean significant difference，P<0.05

2.4 ENPP2蛋白的表達

ENPP2在牦牛卵巢、輸卵管和子宮中均有表達(圖6)。在卵巢中，妊娠期ENPP2的相對表達量明顯高于卵泡期和黃體期；在輸卵管中，各時期ENPP2蛋白的相對表達量有顯著差異，從高到低依次為黃體期、妊娠期和卵泡期；在子宮中，妊娠期ENPP2的相對表達量明顯低于卵泡期和黃體期。

A.卵巢；B.輸卵管;C.子宮;1、2、3分別表示卵泡期、黃體期、妊娠期;不同的小寫字母代表ENPP2蛋白表達差異顯著，P<0.05A.Ovary；B.Oviduct；C.Uterus;1，2，and 3 indicate follicular phase，luteal phase，and pregnancy;Different lowercase letters mean significant differences in ENPP2 protein expressions，P<0.05

2.5 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的定位

ENPP2蛋白在母牦牛卵巢、輸卵管和子宮中均有陽性表達(圖7)，在卵巢中，妊娠期和黃體期ENPP2主要表達在黃體細胞(CL)，卵泡期主要表達在卵泡膜(TF)和卵泡顆粒層(SG)；輸卵管中，各時期表達無顯著差異，其主要表達在黏膜上皮(EM)；子宮中，各時期表達無顯著差異，主要表達在子宮腺(UG)和子宮內膜(EP)。

A～I為免疫組織化學染色;其中 A-F為陽性表達;G、H、I為陰性對照；A、D為卵巢；B、E為輸卵管；C、F為子宮。EM.黏膜上皮；SG.顆粒層；TF.卵泡膜；CL.黃體細胞；EP.子宮內膜； UG.子宮腺；A、B、C、D、E、F中右上角為黑色區(qū)域高倍圖

3 討論

本研究成功克隆出了牦牛Enpp2基因，總長度為2 669 bp，共編碼875個氨基酸。同源性分析結果為牦牛Enpp2基因與牛的相似度最高(99%)，與狐獴的相似度最低(89%)。Enpp2基因在進化過程中具有與高度保守性，且在種屬之間存在差異性。生物信息學推測結果表明Enpp2基因編碼的蛋白質有信號肽，Jansen S[10]研究發(fā)現(xiàn)ENPP2的N-末端疏水基是信號肽，這與本試驗推測的結果一致。本研究結果表明ENPP2蛋白是一種不穩(wěn)定的可溶性蛋白。研究表明溶血磷脂酶D(lysoPLD)是ENPP2的可溶性形式[11]，與本試驗推測結果相一致。牦牛Enpp2基因與?；蛳嗨贫茸罡?，Enpp2基因編碼的蛋白有信號肽，是一種不穩(wěn)定的可溶性蛋白。

本試驗研究表明,ENPP2在卵巢妊娠期相對表達量顯著高于卵泡期和黃體期，ENPP2在各時期卵巢黃體細胞中有表達。說明ENPP2參與牦牛妊娠的維持。在妊娠期孕酮激素分泌增加，因此ENPP2的表達很可能受到孕酮的正向調節(jié)。ENPP2表達定位于牦牛卵巢的卵泡膜和顆粒細胞中，卵泡膜作為卵泡的重要組成部分，在卵泡發(fā)生發(fā)育發(fā)揮著重要作用。Sinderewicz E等[12]和Boruszewska D等[13]研究表明ENPP2在牛卵泡的發(fā)生發(fā)育過程中起作用。綜上推斷ENPP2可能參與牦牛妊娠的維持和卵泡的發(fā)育。

ENPP2在不同繁殖階段牦牛輸卵管中普遍表達，與前人研究其在黃牛輸卵管中的表達結果一致[13]。ENPP2在牦牛黃體期輸卵管中表達最高，妊娠期次之，卵泡期最低。在卵泡期，隨著卵泡發(fā)育，雌激素的合成與分泌逐漸增加，而孕激素在相對較低的水平，輸卵管黏膜上皮持續(xù)生長、增殖，有少量分泌細胞；在黃體期，伴隨黃體的形成，雌激素的分泌下降，而孕激素水平顯著上升，此時輸卵管黏膜上皮纖毛細胞則會出現(xiàn)去纖毛化現(xiàn)象，分泌細胞明顯增多，為運輸卵子做準備[14]。ENPP2在牦牛輸卵管中的表達部位為黏膜上皮，輸卵管黏膜上皮主要由纖毛細胞和分泌細胞組成。Sinderewicz E等[9]研究表明由ENPP2促進生成的LPA可能參與配子的轉運、受精和輸卵管與卵丘-卵母細胞復合體之間的細胞信號傳導。綜上所述，ENPP2可能通過LPA參與卵子的運輸、受精并與早期妊娠有關，且ENPP2可能受到孕酮激素的正向調節(jié)。

子宮是動物孕育胎兒的場所。子宮內膜是子宮中孕育胎兒的重要結構，其具有分泌功能，子宮腺是子宮中的分泌腺，其對胎兒的發(fā)育非常關鍵。免疫組化結果顯示，妊娠期ENPP2表達定位于牦牛的子宮內膜及子宮腺中。因此，ENPP2可能在胎兒發(fā)育過程中發(fā)揮作用。有學者研究發(fā)現(xiàn)ENPP2在綿羊和豬子宮中均有表達，本研究發(fā)現(xiàn)ENPP2在牦牛子宮中，卵泡期和黃體期表達顯著高于妊娠期，與豬[9]子宮中的表達規(guī)律基本一致。Seo H等[8]和Boruszewska D等[15]研究ENPP2促進產生的LPA可能在豬及牛胚胎的著床和妊娠的建立中起關鍵作用，因此，ENPP2可能參與妊娠的建立及胎兒的發(fā)育。

本研究成功克隆牦牛Enpp2基因，登錄號為MW030285；其ORF全長為2 669 bp，共編碼875個氨基酸，此基因表現(xiàn)為高度保守且種屬之間存在顯著差異；ENPP2蛋白是一種不穩(wěn)定的可溶性蛋白，具有信號肽。ENPP2在牦牛不同繁殖階段的生殖器官中均有表達且表達存在差異性。ENPP2蛋白定位在卵泡膜、卵泡顆粒層、黃體細胞、輸卵管的生殖上皮、子宮腺、子宮內膜。本研究結果提示ENPP2可能參與卵子的發(fā)生發(fā)育、運輸以及維持妊娠和胎兒的發(fā)育。