潘興學(xué)，呂一舟，王文麗，麻武仁，劉迎秋，宋曉平，范云鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

麥冬為百合科植物麥冬的干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘、微苦，性微寒，具有潤肺生津、清熱養(yǎng)陰的功效，用于治療肺燥干咳、喉痹咽痛、陰虛癆嗽、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥，被列為滋陰之要藥[1]。麥冬多糖(OP)作為麥冬的主要活性成分之一，具有增強免疫、耐缺氧、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用[2]。脂質(zhì)體是由一個或多個磷脂雙分子層組成的球形囊泡，是一種有效的藥物載體[3]。脂質(zhì)體作為藥物載體，具有提高藥效和生物利用度、降低藥物毒性、減少不良反應(yīng)等優(yōu)點[4]。研究證明，中藥多糖被脂質(zhì)體包封后能顯著增強其免疫活性[4-5]。

MicroRNAs(miRNAs)是一種非編碼小RNA分子，由18個～22個核苷酸組成。miRNAs能夠在mRNA水平調(diào)控靶蛋白的表達[6]。研究證明中藥及其有效成分對miRNAs有廣泛的調(diào)控作用，如黃芪多糖通過調(diào)控miR-127保護H9c2細胞免受脂多糖誘導(dǎo)的炎癥損傷[7]；當(dāng)歸多糖通過調(diào)控miR-223保護PC-12細胞免受脂多糖誘導(dǎo)的損傷[8]。

本試驗在前期證明，麥冬多糖制備成麥冬多糖脂質(zhì)體(OPL)后，能夠顯著提高其免疫活性[4]，并通過高通量測序法確定miR-14與OPL免疫調(diào)節(jié)活性相關(guān)，但作用機制尚不清楚。因此在本試驗中，以枯否是細胞(KCs)為模型，通過Griess、熒光染色、流式細胞術(shù)等方法研究了miR-14對OPL調(diào)節(jié)免疫活性的影響，旨在進一步探究OPL調(diào)節(jié)免疫活性的作用機制，為新型中藥免疫增強劑的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物和細胞 OPL，西北農(nóng)林科技大學(xué)中獸醫(yī)藥實驗室前期制備所得；用完全培養(yǎng)基將OPL稀釋為125、62.5、31.25 μg/mL 3個濃度，于4 ℃儲存?zhèn)溆?。小鼠源KCs，購自美國北納生物公司。

1.1.2 主要試劑 miR-14 mimic、miR-14 inhibitor、mimic negative control(mimic NC) 、inhibitor negative control(inhibitor NC)，廣州銳博生物科技有限公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；亞硝酸鹽測定試劑盒、一氧化氮合成酶(iNOS)分型測試盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；FITC-dextran，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；Hoechst 33258染色液，F(xiàn)ITC-OVA北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；PE-CD14、FITC-MHC Ⅱ，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；ROS檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；5×Integrated RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Fast Real time PCR Master Mixture(Green)熒光定量試劑盒，北京迪寧生物科技有限公司產(chǎn)品；miR-14，U6引物，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 FACSAriaTM流式細胞儀，美國BD公司產(chǎn)品；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；CX23倒置顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；ICX41熒光倒置顯微鏡，舜宇光學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；TC-XP型PCR擴增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；CFX Connect熒光定量基因擴增儀，美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 KCs細胞準(zhǔn)備 從液氮罐里取出KCs，置于37 ℃恒溫水浴鍋中快速融化，加入3 mL完全培養(yǎng)基混勻，1 200 r/min離心8 min后棄上清，PBS洗1遍后加入完全培養(yǎng)基重懸混勻，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor后miR-14的表達 將KCs鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中，在細胞長至30%～40%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書上的步驟，將miR-14 mimic或miR-14 inhibitor以及相應(yīng)的NC，以50 nmol/L的濃度分別單獨轉(zhuǎn)染。繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，用PBS洗2次，向每個孔加入1 mL TRIpure Reagent試劑，按照TRIpure Reagent試劑說明書上的操作步驟進行總RNA的提取，提取的總RNA在5×Integrated RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟的基礎(chǔ)上加入miR-14或U6的反轉(zhuǎn)錄引物(表1)合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板(表1)，以miR-14和U6(內(nèi)參)為引物(表2)，按照2×Fast Real time PCR Master Mixture(Green)試劑盒說明書加反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，2×Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.6 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。real-time PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行分析。

表1 反轉(zhuǎn)錄引物序列

表2 PCR引物序列

1.2.3 miRNA轉(zhuǎn)染及OPL處理 將狀態(tài)良好的KCs鋪于細胞培養(yǎng)板中，在細胞長至30%～40%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書上的步驟，將miR-14 mimic或miR-14 inhibitor以及相應(yīng)的NC，按照50 nmol/L的濃度分別單獨轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)36 h，加入不同濃度OPL(125 μg/mL～31.25 μg/mL)，同時設(shè)定miR-14 mimic control和miR-14 inhibitor control，繼續(xù)培養(yǎng)24 h進行后續(xù)試驗。

1.2.4 NO和iNOS分泌的測定 收集轉(zhuǎn)染并加OPL處理過的細胞上清液，分為兩部分，一部分按亞硝酸鹽檢測試劑盒說明書進行操作，用酶標(biāo)儀于550 nm波長處檢測吸光度(OD)，最后根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NO濃度。另一部分按照iNOS測定試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀于530 nm波長處檢測吸光度，最后根據(jù)說明書上的公式計算iNOS濃度。

1.2.5 熒光染色法檢測KCs吞噬FITC-dextran的活性 用PBS溶解FITC-dextran，并將濃度調(diào)至成1 mg/mL的溶液，4 ℃避光保存。將轉(zhuǎn)染并加OPL處理過的細胞用PBS洗2次，加入FITC-dextran溶液，37 ℃避光孵育1.5 h，PBS洗3次，置熒光顯微鏡下觀測拍照。

1.2.6 熒光染色法檢測KCs吞噬FITC-OVA的活性 將FITC-OVA與完全培養(yǎng)基和不同濃度藥物組混合(40 μg/mL)，置-20 ℃下過夜。將含有FITC-OVA的藥物培養(yǎng)基加入到轉(zhuǎn)染處理過的細胞中，培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次。將組織固定液添加到每個孔中，4 ℃無光固定10 min。然后用PBS清洗細胞2次，每次3 min。將DAPI(5 μg/mL)加入每個孔中，在37 ℃下培養(yǎng)15 min染核。PBS洗滌細胞2次，每次3 min。熒光顯微鏡下觀察細胞對FITC-OVA的吞噬作用并拍照。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測KCs表面分子CD14和MHC Ⅱ的表達 將轉(zhuǎn)染并加OPL處理過的細胞PBS洗2次后，用PBS重懸細胞，同時加入熒光標(biāo)記的抗體(PE-CD14、FITC-MHC Ⅱ)，將細胞懸液置于4 ℃避光30 min，300目網(wǎng)過濾，用流式細胞儀檢測細胞表面分子CD14、MHC Ⅱ的表達水平。

1.2.8 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 將轉(zhuǎn)染并加OPL處理過的細胞用PBS洗2次。加入組織固定液，4 ℃固定1 h。去掉組織固定液，PBS洗3次，加入Hoechst 33258染色液時輕搖細胞板，使染色均勻。室溫靜置10 min。去掉染色液后PBS洗2次。最后每孔加入1滴抗熒光淬滅封片液，置于熒光顯微鏡下進行觀察拍照。

1.2.9 ROS分泌的測定 將轉(zhuǎn)染并加OPL處理過的細胞用PBS洗2次。加入按照1∶1 000無血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA裝載探針。37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔5 min輕搖一下細胞板確保探針裝載均勻。用無血清細胞培養(yǎng)液洗細胞3次，以充分洗去未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，再用PBS洗2次，置于熒光顯微鏡下進行拍照。

1.2.10 細胞劃痕檢測細胞遷移變化 將轉(zhuǎn)染并加OPL處理過的細胞用PBS洗2次，使用1 mL槍頭對細胞劃線，PBS清洗剝落的細胞殘渣，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照，使用Image J軟件分析0 h和24 h細胞劃痕邊界距離，24 h的細胞間距減去0 h的細胞間距即為24 h細胞的遷移距離。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor對miR-14表達的影響

結(jié)果見圖1。轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后的miR-14的表達顯著高于mimic NC組(P<0.05)(圖1A)，轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor的miR-14的表達顯著低于inhibitor NC組(P<0.05)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-14 mimic促進miR-14的表達，轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor抑制miR-14的表達(圖1B)。

A.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后miR-14的表達量；B.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后miR-14的表達量A.Expression level of miR-14 transfected with miR-14 mimic; B.Expression level of miR-14 transfected with miR-14 inhibitor

2.2 OPL對NO和iNOS分泌的影響

結(jié)果見圖2。轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control的NO(圖2A)和iNOS的(圖2B)分泌均顯著低于mimic NC組(P<0.01)，125 μg/mL～31.25 μg/mL OPL組的iNOS的分泌(圖2B)均顯著高于miR-14 mimic control(P<0.01)。轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control的NO(圖2C)和iNOS(圖2D)的分泌均顯著高于inhibitor NC組(P<0.01)，125 μg/mL和62.5 μg/mL OPL組的NO的分泌(圖2C)顯著高于miR-14 inhibitor control(P<0.01)，125 μg/mL～31.25 μg/mL OPL組的iNOS的分泌(圖2D)均顯著高于miR-14 inhibitor control(P<0.01)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后，NO和iNOS的分泌下降；轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，NO和iNOS的分泌上升；OPL能夠促進轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后的iNOS的分泌以及轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后的NO和iNOS的分泌。

A.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后NO的分泌；B.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后iNOS的分泌；C.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后NO的分泌；D.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后iNOS的分泌A.NO secretion in the transfected miR-14 mimic group; B.The secretion of iNOS in the transfected miR-14 mimic group; C.NO secretion in the transfected miR-14 inhibitor group; D.The secretion of iNOS in the transfected miR-14 inhibitor group

2.3 OPL對KCs吞噬FITC-dextran的影響

結(jié)果見圖3。轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control組的綠色熒光多于mimic NC組，31.25 μg/mL組的綠色熒光多于miR-14 mimic control組(圖3A)。轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control組的綠色熒光與inhibitor NC組差異不顯著，62.5 μg/mL組的綠色熒光多于miR-14 inhibitor control。結(jié)果表明，OPL能夠提高轉(zhuǎn)染miR-14 mimic和miR-14 inhibitor后KCs對FITC-dextran的吞噬活性。

A.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic組吞噬FITC-dextran(200×)；B.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor組吞噬FITC-dextran(200×)A.The group transfected with miR-14 mimic phagocytosis of FITC-Dextran (200×); B.The group transfected with miR-14 inhibitor phagocytosis of FITC-Dextran (200×)

2.4 OPL對KCs吞噬FITC-OVA的影響

結(jié)果見圖4。轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control組的綠色熒光多于mimic NC組，62.5 μg/mL組的綠色熒光多于miR-14 mimic control(圖4A)。轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control組的綠色熒光與inhibitor NC組差別不明顯，62.5 μg/mL和31.25 μg/mL組的綠色熒光與miR-14 inhibitor control無明顯差異，125 μg/mL組的綠色熒光多于miR-14 inhibitor control(圖4B)。結(jié)果表明，OPL能夠提高轉(zhuǎn)染miR-14 mimic和miR-14 inhibitor后KCs對FITC-OVA的吞噬。

A.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic組吞噬FITC-OVA(200×)；B.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor組吞噬FITC-OVA(200×)A.The group transfected with miR-14 mimic phagocytosis of FITC-OVA (200×); B.The group transfected with miR-14 inhibitor phagocytosis of FITC-OVA (200×)

2.5 OPL對表面分子CD14和MHC Ⅱ表達的影響

結(jié)果見圖5。轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后，125.25 μg/mL～31.25 μg/mL OPL組的CD14表達量均高于miR-14 mimic control(P<0.01)(圖5B)；125 μg/mL組MHC Ⅱ表達量顯著高于miR-14 mimic control(P<0.01)(圖5C)；轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control組CD14表達量(圖5E)和MHC Ⅱ表達量(圖5F)顯著低于inhibitor NC(P<0.05)，125 μg/mL組的CD14表達量顯著高于miR-14 inhibitor control(P<0.01)(圖5E)，OPL 3個濃度組對MHC Ⅱ的表達量均無影響(圖5F)。結(jié)果表明，OPL對轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后CD14和MHC Ⅱ的表達有顯著的促進作用，對轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后CD14表達有顯著的促進作用。

A.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic流式圖；B.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic 組CD14的表達水平；C.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic組MHC Ⅱ的表達水平；D.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor流式圖；E.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor 組CD14的表達水平；F.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor組MHC Ⅱ的表達水平A.Flow cytometric analysis of cells transfected with miR-14 mimic; B.Expression level of CD14 in transfected miR-14 mimic group; C.Expression level of MHC Ⅱ in transfected miR-14 mimic group; D.Flow cytometric analysis of cells transfected with miR-14 inhibitor; E.Expression level of CD14 in transfected miR-14 inhibitor group; F.Expression level of MHC Ⅱ in transfected miR-14 inhibitor group

2.6 OPL對細胞凋亡的影響

結(jié)果見圖6。轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后，125.25 μg/mL和62.5 μg/mL組的細胞狀態(tài)最佳且無明顯的細胞核發(fā)白，miR-14 mimic control組的細胞核比mimic NC組的更加致密濃染(圖6A)。轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，125 μg/mL組細胞狀態(tài)最好且細胞核發(fā)白率較低，miR-14 inhibitor control和inhibitor NC相比，inhibitor NC的細胞核比miR-14 inhibitor control更加致密濃染(圖6B)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后細胞的凋亡率上升，轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后細胞的凋亡率下降。OPL對轉(zhuǎn)染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor后的細胞凋亡有明顯的抑制作用。

A.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic組凋亡水平(200×)；B.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor組凋亡水平(200×)A.Apoptosis level in the transfected miR-14 mimic group (200×); B.Apoptosis level in the transfected miR-14 inhibitor group(200×)

2.7 OPL對ROS分泌的影響

結(jié)果見圖7。轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control組的ROS高于mimic NC組，125.25 μg/mL和62.5 μg/mL組的ROS均低于miR-14 mimic control(圖7A)；轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control組的ROS與inhibitor NC組差異不明顯，125.25 μg/mL～31.25 μg/mL組的ROS均低于miR-14 inhibitor control(圖7B)。結(jié)果表明，OPL對轉(zhuǎn)染miR-14 mimic和miR-14 inhibitor后ROS的生成有顯著的抑制作用。

A.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic組ROS水平(200×)；B.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor組ROS水平(200×)A.ROS level in the transfected miR-14 mimic group (200×); B.ROS level in the miR-14 inhibitor transfection group (200×)

2.8 OPL對細胞遷移的影響

結(jié)果見圖8。轉(zhuǎn)染miR-14 mimic后，miR-14 mimic control組與mimic NC無顯著差異，OPL 3個濃度組對細胞遷移能力均無影響(圖8A)；轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，miR-14 inhibitor control組與inhibitor NC無顯著差異，31.25 μg/mL組的細胞遷移能力顯著低于miR-14 inhibitor control(P<0.05)(圖8B)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor后，細胞遷移能力無變化，31.25 μg/mL濃度的OPL對轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor的細胞遷移能力有抑制作用。

A.轉(zhuǎn)染miR-14 mimic組細胞遷移(40×)；B.轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor組細胞遷移(40×)A.Cell migration in the transfected miR-14 mimic group (40×); B.Cell migration in the miR-14 inhibitor transfected group (40×)

3 討論

KCs是肝臟固有巨噬細胞，來源于骨髓中的單核細胞[9]，占全身巨噬細胞總數(shù)的80%～90%，約占肝臟細胞總數(shù)的15%[10]。研究證明，普通藥物脂質(zhì)體進入體內(nèi)后主要被肝、脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的單核-巨噬細胞(尤其是肝臟的KCs)攝取，從而激活機體的自身免疫功能[11]。故本試驗選擇KCs作為細胞模型。

NO的生物學(xué)作用廣泛，是哺乳動物體內(nèi)重要的第二信使分子。iNOS是一種非鈣依賴的合成酶，主要通過L-精氨酸途徑合成NO[12]。NO的半衰期很短，對NO功能的研究以一氧化氮合酶的活性調(diào)控為基礎(chǔ)[13]。有研究證明中藥及其有效成分可以通過調(diào)控miRNAs來調(diào)節(jié)NO和iNOS的分泌，如三七皂苷可以通過調(diào)控miR-23a的表達來調(diào)節(jié)對NO和iNOS的分泌從而調(diào)節(jié)IRF-1的表達[14]。本試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-14 mimic抑制NO和iNOS的分泌，OPL能夠促進iNOS的分泌；轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor促進NO和iNOS的分泌，OPL能夠進一步促進iNOS和NO的分泌。由此可推斷，miR-14能夠調(diào)控NO和iNOS的分泌，OPL通過下調(diào)miR-14的表達來促進NO和iNOS的分泌。

吞噬是KCs重要的功能之一[15]。吞噬作用是指細胞通過細胞膜表面褶皺和伸出的偽足吞噬病原體等多種致病因子，并通過吞噬溶酶體內(nèi)的多種水解酶消解和清除病原體，是機體發(fā)揮非特異性免疫的主要方式之一[16]。研究證明OPL可以顯著提高KCs的吞噬活性[17]。本試驗測定了轉(zhuǎn)染miR-14后OPL對KCs吞噬FITC-dextran和FITC-OVA能力的影響，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-14 mimic和miR-inhibitor后基本均能提高KCs的吞噬活性，OPL的不同濃度能夠進一步促進KCs的吞噬。由此可推斷出KCs的吞噬活性不完全受miR-14的調(diào)控，OPL可能會通過其它途徑促進KCs的吞噬。

CD14是存在于單核細胞等細胞表面的白細胞分化抗原，分子質(zhì)量約為55 ku，是一種糖蛋白[18-19]，在疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸方面起著重要的作用。MHC Ⅱ位于抗原遞呈細胞表面，如巨噬細胞、單核細胞等。KCs是誘導(dǎo)淋巴細胞增殖的主要細胞，且這種誘導(dǎo)作用受MHC Ⅱ類分子限制[20]。研究證明miRNAs參與調(diào)控CD14的表達，如轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic會上調(diào)CD14的表達水平，轉(zhuǎn)染miR-146a-5p inhibitor會下調(diào)CD14的表達水平[21]。本試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-14 mimic對CD14和MHC Ⅱ的表達沒有顯著影響，但轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后能顯著抑制CD14和MHC Ⅱ的表達，而OPL能夠進一步促進CD14和MHC Ⅱ的表達，表明OPL可能通過下調(diào)miR-14來調(diào)節(jié)CD14和MHC Ⅱ的表達。

熒光染料Hoechst 33258常用于細胞凋亡的檢測，Hoechst 33258能少許進入正常細胞，而凋亡細胞由于膜通透性增強，染色體DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等原因，會導(dǎo)致Hoechst 33258在細胞內(nèi)積累，從而熒光作用強于正常細胞。研究證明中藥及其有效成分會通過調(diào)控miRNAs來調(diào)節(jié)細胞的凋亡，如枸杞多糖通過調(diào)控miR-122的表達來抑制H9c2細胞凋亡[22]；黃芪多糖通過調(diào)控miR-138來降低大鼠神經(jīng)干細胞的凋亡來減輕細胞的氧化損傷[23]。試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-14 mimic促進細胞的凋亡，轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor抑制細胞的凋亡，OPL能夠抑制轉(zhuǎn)染miR-14 mimic或miR-14 inhibitor的細胞凋亡，表明OPL能夠通過下調(diào)miR-14的表達來抑制細胞凋亡，與枸杞多糖和黃芪多糖的研究結(jié)果相似[22-23]。

ROS被認為是細胞代謝的有毒產(chǎn)物，主要由大多數(shù)動物細胞中的線粒體產(chǎn)生，并作為信號分子參與細胞應(yīng)激期的氧化反應(yīng)[24]。研究證明中藥及其活性成分可以通過調(diào)控miRNAs的表達來影響ROS的分泌[25,26]。本試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-14 mimic促進ROS的分泌，轉(zhuǎn)染miR-14 inhibitor后，ROS的分泌無明顯變化，而OPL能夠抑制轉(zhuǎn)染miR-14 mimic和miR-14 inhibitor后KCs ROS的分泌。表明OPL通過下調(diào)miR-14的表達來降低ROS的分泌。

綜上所述，OPL能夠通過調(diào)控miR-14來調(diào)節(jié)KCs中NO和iNOS的分泌、CD14和MHC Ⅱ的表達、細胞凋亡、ROS分泌，從而發(fā)揮免疫活性作用。