劉肖利，劉璐瑤，李鑌罡，李 斌，裴文剛，程 彪，蘇戰(zhàn)強(qiáng)*,李勤凡

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)屬于環(huán)境性致病菌，是引起奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、腹瀉病和敗血癥等疾病的主要病原菌[1]。近幾年，由大腸埃希氏菌引起的乳房炎發(fā)病率已增至28.39%[2]，其中環(huán)境污染是該病感染的主要來源，一般治愈率相對較低，給動(dòng)物乳腺組織造成永久性的損傷[3]，導(dǎo)致產(chǎn)奶量和乳制品質(zhì)量明顯降低，給奶產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅著人類的健康[4]。目前在治療大腸埃希氏菌性乳房炎時(shí)主要以抗生素為主，但隨著臨床治療過程中抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致大腸埃希氏菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，其多重耐藥現(xiàn)象也呈上升趨勢[5]。大腸埃希氏菌的致病性與其攜帶的多種毒力基因有關(guān)[6-7]，主要包括黏附素基因、毒力島基因、外膜蛋白基因等[8-9]。新疆地區(qū)是我國畜牧業(yè)大省，奶產(chǎn)業(yè)在新疆經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位，但奶牛乳房炎的流行嚴(yán)重制約了奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為了解目前新疆部分地區(qū)大腸埃希氏菌性奶牛乳房炎的致病性與耐藥性，從新疆烏魯木齊、伊犁、昌吉地區(qū)的7個(gè)奶牛場采集乳房炎奶牛牛乳樣本，分析新疆部分地區(qū)引起奶牛乳房炎的大腸埃希氏菌毒力基因攜帶及耐藥情況，為牛場奶牛乳房炎的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集及處理 2019年9月至2020年6月，在新疆烏魯木齊、伊犁、昌吉地區(qū)7個(gè)奶牛場(奶牛場編號為A～G)采集142頭乳房炎患病奶牛的乳汁樣本，共142份。采樣前先將患病奶牛的乳頭清洗干凈后，再用750 mL/L的酒精棉擦拭，使用消毒紙巾擦干后，將前3把乳汁棄去，采集第3把以后的乳汁置于50 mL無菌管中，做好標(biāo)記后放入采樣箱送實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.1.2 主要試劑 革蘭氏染色液，珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；腦心浸出液肉湯(Brain Heart Infusion Broth BHI)、Mueller-Hinton瓊脂(MH)、麥康凱瓊脂(MacConkey Agar)、伊紅美藍(lán)瓊脂(Eosin Methylene Blue Agar)，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master Mix、ddH2O，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；11種腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管、13種藥敏紙片：氧氟沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、克林霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 普通光學(xué)顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD型凈化工作臺，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；DYY-7C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；DHP-9082B型恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TS-2102C型恒溫振蕩器，山海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司產(chǎn)品；HVE-50型高溫高壓滅菌鍋，日本Hirayayama制造公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng),Transilluminator Jvlabo公司產(chǎn)品。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明系小鼠，雌雄各半，體重20 g～25 g，共245只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希氏菌的分離鑒定 將奶樣接種于BHI液體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)后，使用接種環(huán)蘸取菌液劃線于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h，觀察菌落特征進(jìn)行初步鑒定；然后將純化后的疑似菌株于BHI液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定；最后采用水煮法提取分離菌DNA作為模板，根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道的細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。50 μL反應(yīng)體系包括：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，最后ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 min，電壓120 V，使用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，并將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.2 耐藥性檢測 采用K-B紙片擴(kuò)散法選取氧氟沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、克林霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素等13種常用藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；從伊紅美藍(lán)平板上挑取單菌落接種于BHI肉湯過夜增菌培養(yǎng)后，將菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，?00 μL均勻涂布于MH培養(yǎng)基上，然后將藥敏紙片分別貼于MH培養(yǎng)基表面，放入培養(yǎng)箱37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h～12 h，測量抑菌圈直徑。藥敏結(jié)果根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)( CLSI) 制定的標(biāo)準(zhǔn)判定[11]。

1.2.3 毒力基因檢測 根據(jù)奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌攜帶的主要毒力基因進(jìn)行PCR檢測，參照文獻(xiàn)[12-17]中報(bào)道的引物序列，合成大腸埃希氏菌毒力基因astA、sepA、escV、hlyA、fyuA、ler、irp2、iucD、eaeA共9對特異性引物，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。9種毒力基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相同，25 μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。astA、escV基因的PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。sepA、hlyA、fyuA、ler、irp2、iucD、eaeA基因的PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)紫外凝膠成像觀察，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

表1 PCR引物信息

1.2.4 小鼠攻毒試驗(yàn) 將48株分離菌分別接種BHI肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h；試驗(yàn)組每組5只，另取5只做對照組，用生理鹽水將菌液稀釋至1×109CFU/mL，小鼠禁食禁水12 h后，將試驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射攻毒菌液0.5 mL/只，同時(shí)將5只空白對照組小鼠注射等量生理鹽水，觀察24 h～48 h內(nèi)小鼠發(fā)病及死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌分離鑒定結(jié)果

該分離菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長為紅色、有光澤、隆起的菌落(圖1)；在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上生長為黑色帶金屬光澤的典型菌落(圖2)；革蘭氏染色鏡檢均為兩端鈍圓、成對或散在分布的革蘭氏陰性短桿菌(圖3)。能分解葡萄糖、乳糖，賴氨酸、鳥氨酸、衛(wèi)矛醇、靛基質(zhì)試驗(yàn)多數(shù)呈陽性，尿素、硫化氫、苯丙氨酸、西蒙氏枸櫞酸鹽等試驗(yàn)呈陰性，結(jié)果共有48株分離菌符合大腸埃希氏菌生化特性。使用細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在1 500 bp處出現(xiàn)目的片段(圖4)，將測序結(jié)果經(jīng)Blast分析，與大腸埃希氏菌的同源性均在99%以上，結(jié)果表明48株分離菌均為大腸埃希氏菌。

圖1 分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖3 分離菌的染色特性(1 000×)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;-.陰性對照；1～23.分離菌株

2.2 耐藥性檢測結(jié)果

使用9大類13種常用抗菌藥物對48株大腸埃希氏菌分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示(圖5)，分離株對13種抗菌藥物均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，對青霉素G的耐藥率高達(dá)85.4%，對克林霉素的耐藥率為43.8%，阿莫西林、氨芐西林、頭孢唑啉的耐藥率均為41.7%，四環(huán)素的耐藥率在37.5%，氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素的耐藥率均為29.2%，鏈霉素的耐藥率為27%，頭孢他啶的耐藥率為25%，復(fù)方新諾明的耐藥率為20.8%，紅霉素的耐藥率較低，僅為12.5%。所有菌株均對3類或3類以上的抗菌藥物耐藥。

1.青霉素G；2.克林霉素；3.阿莫西林；4.氨芐西林；5.頭孢唑啉；6.四環(huán)素；7.氧氟沙星；8.環(huán)丙沙星；9.慶大霉素；10.鏈霉素；11.頭孢他啶；12.復(fù)方新諾明；13.紅霉素

2.3 大腸埃希氏菌毒力基因的PCR檢測結(jié)果

通過PCR對48株大腸埃希氏菌分離菌的9種常見毒力基因進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示(圖6)，9種毒力基因共檢出了irp2、FyuA、astA、iucD、ler、escV、eaeA7種毒力基因，目的片段大小分別為413、953、111、714、196、544和375 bp，hlyA、sepA基因未檢測出；在48株大腸埃希氏菌分離株中，其中有35株共檢測出7種毒力基因，總檢出率為72.92%(35/48)，檢出的毒力基因分別是iucD(35.41%)、FyuA(16.7%)、irp2(16.7%)、astA(16.7%)、escV(4.17%)、eaeA(4.17%)、ler(4.17%)(圖7)；且分離株檢出的7種毒力基因中，有FyuA+irp2和escV+eaeA+ler2種毒力基因組合，檢出率分別為16.67%(8/48)和4.17%(2/48)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;-.陰性對照；1.irp2；2.FyuA；3.astA；4.iucD；5.ler；6.escV；7.eaeA；8.hlyA；9.sepA

1.iucD；2.FyuA；3.irp2；4.astA；5.escV；6.eaeA；7.ler；8.hlyA；9.sepA

2.4 小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果

小鼠腹腔注射攻毒菌液后，出現(xiàn)精神委頓、厭食、被毛蓬松、呼吸急促等癥狀；試驗(yàn)組小鼠在24 h～48 h內(nèi)均有死亡，死亡率為60%～100%，對照組小鼠正常；剖檢病死小鼠可從肝臟等實(shí)質(zhì)器官中分離到攻毒菌，表明分離菌株均具有致病性。

3 討論

近年來，由大腸埃希氏菌引起的乳房炎感染比較嚴(yán)重。本試驗(yàn)從7個(gè)奶牛場均檢測并分離出大腸埃希氏菌，分離率為33.8%(48/142)；Verbeke J等[18]報(bào)道的奶牛乳房炎大腸埃希氏菌分離率低于本試驗(yàn)；衡水地區(qū)[19]和杭州地區(qū)[20]與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致；而在新疆石河子地區(qū)[21-22]的報(bào)道中，奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌的分離率均低于本試驗(yàn)。大腸埃希氏菌的流行情況可能與不同地區(qū)奶牛場的飼養(yǎng)環(huán)境條件存在差異性有關(guān)。

臨床上在治療大腸埃希氏菌引起的奶牛乳房炎時(shí)，主要以抗菌藥物為主，但是也導(dǎo)致了菌株耐藥性不斷增強(qiáng)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸埃希氏菌普遍對青霉素G、克林霉素、阿莫西林、氨芐西林等具有較高的耐藥性，對紅霉素的耐藥率較低，且具有多重耐藥性。因此，在臨床治療乳房炎時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選敏感性藥物進(jìn)行該病的治療。據(jù)國外報(bào)道[23-24]，奶牛乳房炎大腸埃希氏菌已對青霉素、鏈霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明等多種抗菌藥物耐藥；石潤佳等[25]報(bào)道的華北地區(qū)乳房炎奶樣中分離的大腸埃希氏菌對β-內(nèi)酰胺類藥物和林可酰胺類藥物出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，分離株至少耐4種，最多耐19種抗菌藥物；張金寶等[26]報(bào)道的寧夏地區(qū)分離的大腸埃希氏菌對氨芐西林的耐藥率為54.69%，對四環(huán)素和鏈霉素等的耐藥率為39%，對頭孢唑啉和喹諾酮類等藥物敏感；馬博等[27]報(bào)道的新疆石河子地區(qū)分離的大腸埃希氏菌對青霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類等均產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，且耐多種抗菌藥物的情況比較普遍。本研究結(jié)果表明，新疆部分地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希氏菌對臨床多種常用抗菌藥物產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，這可能與不同牛場長期使用抗菌藥物或者用藥習(xí)慣有關(guān)，且不同地區(qū)大腸埃希氏菌的耐藥性存在一定程度的差異性。

由大腸埃希氏菌導(dǎo)致的乳房炎與該菌攜帶的毒力基因有著重要的聯(lián)系。本研究對分離出的48株大腸埃希氏菌進(jìn)行了9種常見毒力基因的檢測，共檢出7種毒力基因，其中有35株大腸埃希氏菌攜帶毒力基因，總檢出率為72.92%(35/48)，檢出的毒力基因分別為irp2、FyuA、astA、iucD、ler、escV、eaeA基因。Suojala L[3]等報(bào)道的從奶牛乳房炎分離的大腸埃希氏菌中檢測到irp2、iucD、astA、eaeA基因，其檢出率低于本研究；張金寶等[26]報(bào)道的寧夏地區(qū)分離的大腸埃希氏菌中檢測到astA、escV、eaeA基因，其檢出率高于本研究，而于偉偉等[28]在新疆地區(qū)分離的大腸埃希氏菌中，irp2、astA基因的檢出率也高于本研究，但iucD基因的檢出率遠(yuǎn)低于本研究；大腸埃希氏菌攜帶的毒力基因分布可能存在地域性差異。小鼠攻毒試驗(yàn)表明，所有分離株均具有致病性，表明新疆部分地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希氏菌的致病性較強(qiáng)。

新疆部分地區(qū)乳房炎大腸埃希氏菌感染情況嚴(yán)重，攜帶iucD、FyuA、irp2、astA、escV、eaeA、ler等毒力基因，且具有較強(qiáng)致病性和多重耐藥性。