劉恩琪，馬麗瑩，黃舒萍，尤 丹，郭立君，劉 丹，徐海濤，郜 旭，王亞君*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江東北虎林園，黑龍江哈爾濱 150028；3.黑龍江邊防檢查總站哈爾濱警犬訓(xùn)練基地，黑龍江肇東 151121)

貓獲得性免疫缺陷綜合征(Feline acquired immu-nodeficiency syndrome,FAIDS)是由貓免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus,FIV)感染引起的主要侵害貓科動(dòng)物免疫系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致其他細(xì)菌、病毒的繼發(fā)感染，最終造成動(dòng)物死亡的一種慢性接觸性傳染病。由于它在基因組、生化特性、致病機(jī)制等方面均與人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)相似，故也稱為貓艾滋病，臨床常把FIV作為HIV研究的動(dòng)物模型[1-2]。FIV廣泛分布于全世界，自然情況下可感染20多種貓科動(dòng)物[3-6]，基因組全長約為9 500 bp，包括3個(gè)主要的開放閱讀框gag、pol和env，通過env基因的V3-V5高變區(qū)可將FIV分為7種亞型(A、B、C、D、E、F和U-NZenv)；此外，研究表明gag基因也能證實(shí)亞型A-E[7-8]。

東北虎是世界上體型最大的貓科動(dòng)物之一，由于數(shù)量稀少已被國際自然保護(hù)聯(lián)盟確認(rèn)定為瀕危物種[9]。目前，國內(nèi)關(guān)于FIV的研究十分有限，東北虎因?yàn)闃颖静杉y度大，全球可獲取到的虎源FIV序列也僅有1個(gè)450 bp的gag基因片段和1個(gè)505 bp的pol基因片段[4]。通過本研究，不但可以為東北虎FIV監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持，還可以豐富貓科動(dòng)物FIV流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫，為野生貓科動(dòng)物FIV進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源與儲(chǔ)存 黑龍江省海林市橫道河子?xùn)|北虎林園東北虎全血50份，置于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.1.2 主要試劑 Baypure通用型磁珠法病毒DNA/RNA快速提取試劑盒，廣州灣區(qū)生物科技有限公司產(chǎn)品；1.1×T3 Super PCR Mix，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RNase抑制劑、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Promega公司產(chǎn)品；DEPC水、瓊脂糖、TAE(50×)溶液、核酸染料GoldView，Biosharp公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 微量移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品；生物安全柜，上海力辰邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；BBEX-32核酸提取儀，廣州灣區(qū)生物科技有限公司產(chǎn)品；MK-20干式恒溫器，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；SEDI熱循環(huán)儀、GES水平電泳槽、ELITE 300 Plus電泳儀電源，Wealtec公司產(chǎn)品；ZF-4型紫外透射儀，上海光豪分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取與反轉(zhuǎn)錄 按照Baypure通用型磁珠法病毒DNA/RNA快速提取試劑盒的說明書從全血中提取病毒核酸。將4 μL隨機(jī)引物加入含有核酸的無RNA酶的EP管內(nèi)，并置于干式恒溫器70 ℃培養(yǎng)5 min，再放入-20 ℃冰浴5 min。之后向EP管加入10 μL M-MLV 5×buffer、8 μL dnTP、 6 μL DEPC水、1 μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑，于37 ℃培養(yǎng)1 h后繼續(xù)-20 ℃冰浴5 min，并置于-20 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 套式PCR 根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]，選擇pol基因的P3F- P5R和P4F-P4R引物進(jìn)行套式PCR，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，cDNA 1 μL，上游引物(P3F/P4F)和下游引物(P5R/ P4R)各1 μL，總體積為25 μL。擴(kuò)增程序如下：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物凝膠電泳并測(cè)序。

1.2.3pol基因片段序列分析 將所測(cè)序列與同源序列對(duì)比分析，選取同源性最高的前15個(gè)毒株的序列作為對(duì)應(yīng)病毒基因的參考序列(表1)；并運(yùn)用DNA Star 11軟件的MegAlign程序?qū)λ鶞y(cè)序列進(jìn)行同源性及氨基酸突變位點(diǎn)分析；再利用MEGA-X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

表1 FIV pol基因參考毒株

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果

通過套式PCR技術(shù)，從50只東北虎的全血檢測(cè)出1株FIV 陽性(命名為HD631)，擴(kuò)增出的pol基因片段大小與預(yù)期相符，表明該樣本為FIV陽性，電泳結(jié)果見圖1。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.PCR產(chǎn)物

2.2 同源性分析

HD631毒株與參考毒株pol基因的核苷酸、氨基酸同源性分別為70.0%～99.8%和75.0%～99.4%；且與CHN17毒株的核苷酸、氨基酸同源性最高(圖2)。其中，2株C亞型貓?jiān)碏IV毒株與獅源FIV毒株核苷酸同源性較A亞型貓?jiān)碏IV毒株、HD631毒株高，而氨基酸同源性結(jié)果相反。

圖2 FIV pol基因核苷酸序列同源性分析

2.3 氨基酸突變位點(diǎn)分析

經(jīng)剪切對(duì)齊后，HD631毒株和參考毒株的pol基因部分核苷酸序列長為504 bp，編碼168個(gè)氨基酸；其中Ple-915毒株缺失1個(gè)堿基(第191位)。由表2可知，HD631毒株與參考毒株共存在39個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，可大致分為3類，確定的氨基酸突變情況(3個(gè))、不確定的氨基酸突變情況(32個(gè))及氨基酸存在多態(tài)性(4個(gè))；其中，第2種情況是指不能確定該氨基酸突變的物種來源。

表2 FIV pol基因編碼氨基酸突變位點(diǎn)分析

2.4 遺傳進(jìn)化分析

由圖3可知，F(xiàn)IVpol基因部分核苷酸序列與國內(nèi)外參考序列對(duì)比分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹分為兩個(gè)大分支。就物種而言，HD631毒株與貓?jiān)碏IV毒株處于同一分支，而與獅源FIV毒株處于另一分支。就亞型而言，HD631毒株與以A亞型毒株親緣關(guān)系最近，與C亞型毒株親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，與B亞型毒株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

●代表本研究鑒定的FIV毒株

3 討論

研究結(jié)果顯示，HD631毒株也與CHN17毒株具有最高的核苷酸、氨基酸同源性，分別為99.8%和99.4%；且系統(tǒng)發(fā)育樹顯示該毒株與貓?jiān)碏IV毒株親緣關(guān)系較近，其與A亞型同源性在93%以上、與C亞型同源性在81%以上，而與獅源FIV毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性為70.2%～73.0%。由于該毒株匹配到了兩個(gè)物種的同源序列，因此其氨基酸突變位點(diǎn)多達(dá)39個(gè)；其中Ple-915毒株缺失第191位堿基，翻譯得到的氨基酸數(shù)較其他毒株少1個(gè)，但不影響結(jié)果的分析。就本結(jié)果而言，可以確定突變氨基酸的有3個(gè)位點(diǎn)，分別是第45、79、162位；氨基酸存在多態(tài)性的有4個(gè)位點(diǎn)，分別是第32、34、49、56位；剩下的32個(gè)位點(diǎn)不確定氨基酸突變來自貓?jiān)催€是獅源。有趣的是，盡管C亞型貓?jiān)碏IV毒株與獅源FIV毒株氨基酸同源性較A亞型貓?jiān)碏IV毒株、HD631毒株低，但C亞型毒株在部分氨基酸突變中與獅源毒株保持一致。此外，在氨基酸突變位點(diǎn)的分析中也驗(yàn)證了HD631毒株與CHN17毒株的高度一致性，兩者幾乎在所有突變位點(diǎn)中都為同一種氨基酸。由于這些結(jié)果是針對(duì)于不同物種分析的，且參考毒株數(shù)量有限，可能上述氨基酸在虎這個(gè)物種并不存在突變，這一推測(cè)還需要獲得更多不同地區(qū)不同樣本的該基因序列進(jìn)行驗(yàn)證。

在眾多關(guān)于家貓的FIV研究中均以env基因的V3-V5高變區(qū)鑒定病毒亞型，但在大型貓科動(dòng)物(如獅子、美洲獅等)中則以高度保守的pol基因進(jìn)行分型，且pol基因的遺傳進(jìn)化分析顯示出具有物種特異性[5,8,10]。因此，老虎FIV的亞型鑒定可能也是由pol基因決定的。上述結(jié)果顯示，HD631毒株的pol基因核苷酸、氨基酸序列與所有A亞型的貓?jiān)碏IV毒株同源性分別高達(dá)94%、92%以上；而與兩株C亞型的貓?jiān)碏IV毒株的同源性僅有70%～80%。因而推測(cè)HD631毒株可能為A亞型。鑒于本試驗(yàn)的結(jié)果和家貓、流浪貓中慢病毒感染的高發(fā)病率，很有必要對(duì)我國圈養(yǎng)東北虎、動(dòng)物園流浪貓及其他圈養(yǎng)貓科動(dòng)物進(jìn)行FIV檢測(cè)，以獲取足夠的數(shù)據(jù)，便于對(duì)FIV進(jìn)一步研究。