李 想，呂 琴，吳秋月，沈 穎△

(1.昆明理工大學醫(yī)學院，昆明 650093；2.昆明理工大學附屬醫(yī)院，昆明 650032；3.云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650032；4.云南中醫(yī)藥大學，昆明 650500)

國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的糖尿病地圖集顯示，2017年全球約有4.51億糖尿病患者，并估計2045年這一數(shù)字將達到6.93億人[1]。目前，全球糖尿病發(fā)病人數(shù)的增加主要在發(fā)展中國家，尤其是印度和中國，其患病率分別排在第1、2位。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預測，2025年我國預計將有1.4億2型糖尿病患者[2]。隨著人們生活水平的提高及人們飲食習慣的改變，肥胖人群逐年上升，肥胖癥與2型糖尿病并存的肥胖相關(guān)的2型糖尿病的患病率也逐年上升，并且肥胖相關(guān)的2型糖尿病的致病機制較常規(guī)2型糖尿病更加復雜[3]。同時糖尿病并發(fā)癥隨糖尿病發(fā)生率上升也隨之升高，其中糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，也是最常見的慢性腎臟病，并且是導致終末期腎臟病的主要原因之一[4]。糖尿病及其并發(fā)癥——DN發(fā)病率逐年升高，已成為世界關(guān)注的全球公共衛(wèi)生問題。一項對全國慢性腎臟病住院患者的調(diào)查結(jié)果顯示，DN住院人數(shù)逐年升高，現(xiàn)已成為慢性腎臟病住院患者人數(shù)最多的病種[5]。近年來，DN的發(fā)病率呈上升趨勢，歸因于DN的社會醫(yī)療負擔越來越重[6]。目前，對DN的治療主要以控制體重、血糖、血壓，以及調(diào)脂等對癥處理[7]，然而現(xiàn)有的治療手段并不能完全阻斷DN進展，尋找新的發(fā)病機制及治療靶點至關(guān)重要。

構(gòu)建良好的DN模型是研究DN的基礎(chǔ)。目前，對DN的模型構(gòu)建方法有多種，化學誘導法為常用的動物模型構(gòu)建方法，以化學藥物——四氫嘧啶或鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)破壞動物胰島細胞，模擬糖尿病胰島素缺乏及血糖升高的病理表現(xiàn)，以構(gòu)建糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的動物模型[8]。影響模型成功的因素很多，其中小鼠品系及小鼠年齡的選擇對造模的影響十分重要[9-10]。目前，化學誘導法常用的動物模型為SD大鼠和Wistar大鼠[10]，其造模成本較高，而實驗室最常用的C57小鼠被認為具有相對的天然DN抵抗[11]。本研究探索具有相對DN抵抗的C57小鼠能否通過常規(guī)高脂高糖飲食聯(lián)合化學誘導法構(gòu)建比較符合肥胖相關(guān)的2型糖尿病并發(fā)癥DN發(fā)病機制的小鼠模型，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選取無特定病原體級雄性C57Bl/6J小鼠，3周齡(12～15 g)、5周齡(18～22 g)各12只(昆明理工大學動物中心)。

1.1.2試劑與儀器

STZ購自美國Sigma公司，高脂高糖飼料(豬油28%、蔗糖10%、全脂奶粉10%，其余均為維持飼料成分)購自江蘇協(xié)同生物公司，Masson三色染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，糖原PAS染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；檸檬酸緩沖液(國產(chǎn))、無水葡萄糖(國產(chǎn))、尿蛋白試紙(優(yōu)利特)、血糖試紙(羅氏)等。包括光學雙目顯微鏡(江南)、石蠟切片機(Leica RM2235)、血糖儀(羅氏)、小鼠灌胃器(國產(chǎn))等。

1.2 方法

1.2.1動物模型的建立

將3周齡、5周齡小鼠分為實驗組和對照組，實驗組給予高脂高糖飲食，對照組給予普通飲食。實驗前對所有小鼠進行空腹血糖測量，入組小鼠要求空腹血糖小于7 mmol/L，排除先天存在血糖異常小鼠。實驗組以高脂高糖飼料飼養(yǎng)8周，定期測量小鼠體重，排除體重不達標小鼠，以體重大于或等于對照組為篩選標準，體重未達標者提示對肥胖誘導耐受或不敏感，將其淘汰。高脂高糖飲食喂養(yǎng)8周后測量小鼠體重，淘汰肥胖誘導耐受小鼠，測定小鼠空腹血糖，進行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)，恢復高脂高糖飲食1 d后實驗組小鼠禁食16 h，以每天50 mg/kg注射STZ，STZ為0.1%檸檬酸緩沖液(pH 4～5)配制的0.5%STZ注射液，采用白天禁食，夜晚注射的方式，連續(xù)注射5 d，末次注射2周后測量空腹血糖，空腹血糖大于16 mmol/L認為中期糖尿病模型構(gòu)建成功，繼續(xù)飼養(yǎng)8周采用尿蛋白試紙檢測小鼠尿蛋白，然后麻醉下灌流處死小鼠，解剖并取小鼠腎臟進行石蠟切片并染色進行腎臟病理學觀察，如出現(xiàn)顯著蛋白尿及腎臟病理改變認為DN模型構(gòu)建成功。

1.2.2血糖測量

使用羅氏血糖儀及血糖試紙，將小鼠固定，用采血針扎入小鼠尾靜脈，取尾靜脈血進行血糖檢測。

1.2.3OGTT

試驗前將小鼠夜間空腹12 h，測量空腹血糖，然后將20%葡糖糖溶液以2 g/kg劑量采用小鼠灌胃器進行灌胃，分別于灌胃后30 min、2 h時測量靜脈血糖。

1.2.4尿蛋白檢測

應(yīng)用尿蛋白檢測試紙采用壓迫膀胱方法，在小鼠膀胱充盈時壓迫膀胱取小鼠尿液，并滴浸于蛋白測定試紙上，通過標準比色條分析檢測結(jié)果。

1.2.5病理檢查

小鼠在麻醉狀態(tài)下灌流取腎臟，放入多聚甲醛中固定，經(jīng)固定組織、脫水、石蠟包埋等步驟，最后用石蠟切片機制作石蠟切片，厚度2 μm。使用過碘酸希夫(PAS)染色及Masson三色染色試劑盒，按試劑盒說明書中步驟對切片進行染色，觀察腎臟腎小球、基底膜和系膜基質(zhì)等病理改變。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 體重變化

2.1.13周齡小鼠

實驗組小鼠高脂高糖飲食飼養(yǎng)8周后體重與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。對照組小鼠體重略大于實驗組，實驗組小鼠均未達篩選標準，3周齡小鼠未誘導出肥胖。

圖1 3周齡小鼠實驗組與對照組體重比較

2.1.25周齡小鼠

實驗組小鼠飼養(yǎng)8周后體重未達標2只，未誘導出肥胖，將其淘汰；其余4只小鼠體重增加明顯，成功誘導出肥胖。實驗組肥胖小鼠體重與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

a:P<0.05,與對照組比較圖2 5周齡小鼠實驗組與對照組體重比較

2.2 飼養(yǎng)8周后5周齡小鼠血糖變化

5周齡小鼠實驗組高脂高糖飼養(yǎng)8周后空腹血糖明顯大于對照組，OGTT在灌胃后30 min時血糖與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，空腹血糖、餐后2 h血糖與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗組小鼠出現(xiàn)早期糖尿病表現(xiàn)，見圖3。

圖3 5周齡小鼠實驗組飼養(yǎng)8周后OGTT與對照組比較

2.3 注射STZ后血糖及癥狀改變

STZ末次注射2周后實驗組小鼠空腹血糖大于16 mmol/L，并出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿現(xiàn)象，出現(xiàn)進展期及中期糖尿病表現(xiàn)。

2.4 尿蛋白測定

末次注射STZ 8周后小鼠尿蛋白試紙測定結(jié)果為陰性，未出現(xiàn)明顯蛋白尿。

2.5 腎臟病理學觀察

與對照組比較，實驗組小鼠腎臟腎小球、基底膜和系膜基質(zhì)等病理結(jié)構(gòu)無明顯改變，見圖4。

A、C：實驗組；B、D：對照組；A、B：Masson三色染色；C、D：PAS染色。圖4 腎臟病理學觀察(400×)

3 討 論

2型糖尿病為主要的糖尿病類型，其中胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，在肥胖相關(guān)的2型糖尿病中脂肪過度堆積導致體內(nèi)代償性分泌胰島素，過度的胰島素分泌從而出現(xiàn)胰島素抵抗[12]；長期高脂高糖飲食、過量高脂高糖食物的攝入損傷胰島細胞，從而出現(xiàn)糖尿病，長期糖尿病微環(huán)境導致腎臟屏障受損及腎臟基底膜增厚并出現(xiàn)腎小球硬化等嚴重腎臟并發(fā)癥[13-14]；本研究利用以上原理構(gòu)建了肥胖相關(guān)糖尿病及DN模型。

本研究結(jié)果顯示，3周齡小鼠難以誘導出肥胖，其原因可能為過早給予高脂高糖飲食，此時小鼠對高脂高糖飲食的消化、吸收能力并未健全，難以誘導出肥胖；5周齡小鼠對高脂高糖飲食敏感，可以較好地誘導出肥胖，并且在高脂高糖飼養(yǎng)8周后空腹血糖、OGTT均與對照組出現(xiàn)了差異，小鼠出現(xiàn)早期糖尿病表現(xiàn)，早期糖尿病模型建立成功，成模率為60%；STZ注射2周后小鼠血糖升高顯著(>16 mmol/L)，并且出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿表現(xiàn)，糖尿病病情進一步加重，中期糖尿病模型建立成功，成模率為60%。而并發(fā)癥——DN模型并未構(gòu)建成功，STZ注射8周后小鼠尿蛋白陰性，且腎臟未見明顯病理改變，提示未誘導出DN，DN模型構(gòu)建失敗。

本研究結(jié)果提示，C57Bl/6J品系小鼠對高脂高糖飲食較為敏感，可以通過高脂高糖飲食構(gòu)建早期2型糖尿病模型，并且可以聯(lián)合STZ注射構(gòu)建進展期及中期2型糖尿病模型，但該品系小鼠通過高脂高糖飲食聯(lián)合STZ注射難以誘導出DN模型。