李紅 聞敏 劉松 陳文萍 周正揚(yáng)

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在所占比例達(dá)80%[2]。Ki67作為細(xì)胞增殖有關(guān)的核抗原，可以反應(yīng)細(xì)胞周期中活性細(xì)胞的比例[3]，與NSCLC增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的病理特征及預(yù)后密切相關(guān)[4-][5]。但目前僅能依靠免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，無(wú)法通過(guò)無(wú)創(chuàng)方法評(píng)估。CT具有簡(jiǎn)單、快速、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，是臨床上肺癌診斷、治療及檢測(cè)的主要影像手段，本研究旨在探討非小細(xì)胞肺癌 CT征象與Ki67表達(dá)的相關(guān)性，評(píng)價(jià)CT在診斷Ki67表達(dá)方面的價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

回顧性分析2017年1月至2018年12月期間南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院經(jīng)手術(shù)及病理確診的NSCLC。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)手術(shù)及病理證實(shí)為NSCLC且具有Ki67免疫組化結(jié)果；(2)術(shù)前接受本院胸部CT檢查，且術(shù)前CT檢查與手術(shù)間隔小于1月。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受腫瘤相關(guān)治療；(2)合并其他肺外其惡性腫瘤；(3)術(shù)前CT圖像質(zhì)量不佳，影響分析。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共230例肺癌患者納入研究。

二、CT檢查方法

胸部CT平掃采用GE VCT 64排，GE Discovery HD 750,Ingenuity Flex16排，聯(lián)影uCT780 64排。掃描參數(shù)為：管電壓120 kV，自動(dòng)毫安，轉(zhuǎn)速0.7 s/圈，矩陣512×512，掃描層厚5 mm，層間距5 mm，重建層厚1.25 mm。掃描范圍自胸廓入口處至肋膈角，受檢者吸氣末一次屏氣完成掃描。

三、圖像評(píng)估及分析

1 定性評(píng)估 由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的放射科醫(yī)師共同評(píng)估CT征象，當(dāng)意見(jiàn)不一致時(shí)討論達(dá)成一致。包括：邊界(不清、清晰)、密度(實(shí)性、混合密度、純磨玻璃)、分葉(無(wú)或有)、毛刺(無(wú)或有)、鈣化(無(wú)或有)、血管集束征(無(wú)或有)、支氣管充氣征(無(wú)或有)、空泡征(無(wú)或有)、空洞(無(wú)或有)、結(jié)節(jié)型/腫塊型(結(jié)節(jié)≤3 cm，腫塊>3 cm)、胸膜增厚(無(wú)或有)、胸膜凹陷征(無(wú)或有)、阻塞性肺氣腫(無(wú)或有)、外周纖維化(無(wú)或有)、胸腔積液(無(wú)或有)、腫大淋巴結(jié)(短徑大于1 cm)、多發(fā)腫大淋巴結(jié)≥3個(gè)。

2 定量評(píng)估 (1)選取最橫截面測(cè)量病灶長(zhǎng)徑及短徑；(2)選擇腫瘤最大層面，測(cè)量平均CT值(CTmean)、最大CT值(CTmax)、最小CT值(CTmin)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，感興趣區(qū)的勾畫需盡量避開(kāi)空洞、空泡、鈣化。

四、免疫組織化學(xué)染色

全部NSCLC組織標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)10%甲醛固定石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片后進(jìn)行免疫組化染色(SP法)檢測(cè)Ki67的表達(dá)情況。Ki67陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色或淺黃色，100倍光鏡下，取任意5個(gè)視野，共計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色陽(yáng)性的細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，≤20%者定義為低表達(dá)，>20%定義為高表達(dá)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0及MedCalc軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料CTmean、CTmax、CTmin、SD及長(zhǎng)徑、短徑不滿足正態(tài)分布及方差齊性，采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組間計(jì)量資料的差異；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)比較組間計(jì)數(shù)資料的差異。將上述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的CT特征構(gòu)建多參數(shù)二元邏輯回歸模型，使用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的CT計(jì)量資料及回歸模型預(yù)測(cè)概率值繪制受試者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，各參數(shù)的診斷效能通過(guò)曲線下面積(AUC)衡量，并評(píng)估敏感度、特異度、準(zhǔn)確度，通過(guò)約登指數(shù)確定最佳閾值。計(jì)量資料采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation，ICC)對(duì)2名醫(yī)師的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行可重復(fù)性評(píng)價(jià)，ICC值<0.40認(rèn)為一致性差，ICC值為0.40～0.75之間認(rèn)為一致性一般，ICC值>0.75認(rèn)為一致性良好。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、非小細(xì)胞肺癌Ki67低表達(dá)組與高表達(dá)組CT參數(shù)的比較

納入的230例NSCLC患者中，高表達(dá)組171例(74.3%)，低表達(dá)組59例(25.7%)，男114例(49.6%)，女116例(50.4%)；年齡范圍28～85歲，平均61±10歲，其中年齡<60歲106例(46.1%)，年齡≥60歲124例(53.9%)。Ki67高表達(dá)病例HE染色及免疫組化染色(見(jiàn)圖1A-B)。

圖1 A-B為同一患者，A：HE染色(×100)：腺泡型為主型腺癌(腺泡型約80%，實(shí)體型約20%)；B：腫瘤細(xì)胞Ki67抗原染色(×100)，Ki67標(biāo)記指數(shù)約40%

CT形態(tài)學(xué)特征分析顯示(表1)：8個(gè)CT特征差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，包括邊界(P=0.005)、密度(P<0.001)、支氣管充氣征(P=0.001)、結(jié)節(jié)型/腫塊型(P<0.001)、阻塞性肺氣腫(P=0.034)、胸腔積液(P<0.001)、腫大淋巴結(jié)(P<0.001)、多發(fā)腫大淋巴結(jié)(≥3個(gè))(P=0.005)(圖2-3)。

表1 Ki67高表達(dá)組與低表達(dá)組間CT分類變量分析[n(%)]

圖2 A-C:為同一患者，男性，77歲，大細(xì)胞肺癌，Ki67高表達(dá)，肺窗示CT示左肺上葉實(shí)性結(jié)節(jié)，病灶周圍伴阻塞性肺氣腫(黑箭頭);縱隔窗示：縱隔及左肺門多發(fā)腫大淋巴結(jié)。圖3 男性，67歲，腺癌，Ki67高表達(dá)，肺窗示右肺中葉腫塊，邊界清晰，內(nèi)見(jiàn)支氣管充氣征。

CT連續(xù)性參數(shù)分析顯示(表2)：5個(gè)參數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為CTmean(P<0.001)、CTmin(P<0.001)、SD(P<0.001)及長(zhǎng)徑(P<0.001)、短徑(P<0.001)，Ki67高表達(dá)組的病灶長(zhǎng)徑、短徑、CTmean、CTmin值均顯著高于低表達(dá)組，而Ki67高表達(dá)組SD值均顯著低于低表達(dá)組。

表2 Ki67 高表達(dá)組與低表達(dá)組間CT連續(xù)參數(shù)的描述性分布[M(Q)]

二、CT連續(xù)性參數(shù)診斷非小細(xì)胞肺癌Ki67表達(dá)情況

CTmean、CTmin、SD及長(zhǎng)徑、短徑在診斷非小細(xì)胞肺癌Ki67表達(dá)效能較好，其AUC值分別為0.790、0.772、0.773、0.772、0.809，以短徑2.00 cm為閾值診斷NSCLC患者Ki67抗原表達(dá)的敏感度為74.6%，特異度為73.1%(見(jiàn)表3)。

三、二元Logistic回歸分析預(yù)測(cè)危險(xiǎn)因素及多參數(shù)模型分析

通過(guò)二元Logistic回歸分析，將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)邊界、密度、支氣管充氣征、結(jié)節(jié)型/腫塊型、阻塞性肺氣腫、胸腔積液、腫大淋巴結(jié)、多發(fā)腫大淋巴結(jié)節(jié)(≥3個(gè))、CTmean、CTmin、SD及長(zhǎng)徑、短徑納入logistic回歸分析并保留預(yù)測(cè)概率值。結(jié)果顯示邊界、密度、支氣管充氣征、阻塞性肺氣腫、多發(fā)腫大淋巴結(jié)節(jié)(≥3個(gè))、CTmin、SD及短徑為有效相關(guān)參數(shù)。

將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的CTmean、CTmin、SD及長(zhǎng)徑、短徑、預(yù)測(cè)概率值進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示多參數(shù)模型預(yù)測(cè)概率值診斷效能最好，AUC值為0.913，以擬合參數(shù)0.306為閾值診斷非小細(xì)胞肺癌患者Ki67表達(dá)的敏感度為88.1%，特異度為83.0%(見(jiàn)圖4、表3)。

表3 Ki67高表達(dá)組與低表達(dá)組間 CT參數(shù)的ROC分析

圖4 logistic回歸模型預(yù)測(cè)概率值及各單因素參數(shù)診斷Ki67表達(dá)水平的ROC曲線。logistic回歸模型預(yù)測(cè)概率值的診斷效能最高，AUC值顯著高于單因素AUC值，曲線下面積為0.913，敏感度為88.1%，特異度為83.0%。

表4示CT連續(xù)性參數(shù)測(cè)量者間的ICC范圍為0.355～0.952。

表4 CT連續(xù)性參數(shù)測(cè)量者間一致性分析

討 論

NSCLC是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[6-7]，嚴(yán)重威脅人們的身心健康與生命安全，Ki67是一種DNA結(jié)合蛋白，僅在活躍增殖的細(xì)胞核中表達(dá)[8]，可準(zhǔn)確反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)行為，是評(píng)估多種腫瘤細(xì)胞增殖及預(yù)后的有效參數(shù)[9-][10]，對(duì)NSCLC的預(yù)后評(píng)估具有重要意義[11]。

對(duì)于連續(xù)變量，測(cè)量者間的ICC范圍在 CTmean、CTmin、SD及長(zhǎng)徑、短徑間的一致性較好，而CTmax一致性較差，推測(cè)原因是CTmax為極值，易產(chǎn)生偏差。CTmean、CTmin、SD、長(zhǎng)徑及短徑在高表達(dá)與低表達(dá)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ki67高表達(dá)組較低表達(dá)組CTmean、CTmin值更高、長(zhǎng)徑及短徑更大，考慮因?yàn)槟[瘤細(xì)胞增生活躍，導(dǎo)致病灶腫瘤細(xì)胞數(shù)目增多，密度增高，病灶體積增大。

對(duì)于分類變量，本研究結(jié)果顯示CT參數(shù)邊界、密度、支氣管充氣征、結(jié)節(jié)型/腫塊型、阻塞性肺氣腫、胸腔積液、腫大淋巴結(jié)、多發(fā)腫大淋巴結(jié)(≥3個(gè))的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(1)高表達(dá)組病灶多為實(shí)性腫塊型，考慮與Ki67高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增生活躍有關(guān)；(2)阻塞性肺氣腫及胸腔積液在高表達(dá)組較低表達(dá)性組發(fā)生率更高，筆者認(rèn)為可能是腫瘤侵襲性增加，浸潤(rùn)細(xì)支氣管導(dǎo)致管腔閉塞引起病灶周圍阻塞性肺氣腫，而當(dāng)腫瘤侵犯胸膜時(shí)容易引起胸腔積液。(3)高表達(dá)組更易出現(xiàn)腫大淋巴結(jié)及多發(fā)腫大淋巴結(jié)，潛在原因可能是KI67高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的增殖力增強(qiáng)及腫瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的粘附導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更易進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，這與文獻(xiàn)提到的Ki67高表達(dá)與腫瘤預(yù)后差相一致[12-13]。

此外，我們聯(lián)合CT影像特征構(gòu)建二元邏輯回歸模型，結(jié)果顯示密度、支氣管充氣征、阻塞性肺氣腫、多發(fā)腫大淋巴結(jié)節(jié)(≥3個(gè))、CTmin、SD及短徑為NSCLC的Ki67表達(dá)有效相關(guān)參數(shù)，多參數(shù)模型對(duì)于診斷Ki67表達(dá)水平的效能較單因素明顯提高，AUC為0.913，敏感度為88.1%，特異度為83.0%，多參數(shù)模型AUC值顯著高于單參數(shù)AUC值。

本研究存在一定局限性：(1)本研究為回顧性分析且所有病例均為手術(shù)病例，可能存在選擇性偏倚；(2)僅研究CT影像特征在診斷非小細(xì)胞肺癌Ki67表達(dá)中的價(jià)值，未考慮臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及病理指標(biāo)的診斷價(jià)值。上述不足有待后續(xù)進(jìn)行更深入的研究來(lái)完善。

綜上所述，本研究回顧性分析230例具有Ki67免疫組化NSCLC 的影像資料，結(jié)果顯示CT參數(shù)聯(lián)合多參數(shù)模型對(duì)于診斷NSCLC的Ki67表達(dá)狀態(tài)具有重要作用，其中密度、支氣管充氣征、阻塞性肺氣腫、多發(fā)腫大淋巴結(jié)節(jié)(≥3個(gè))、最小CT值、SD及短徑為有效相關(guān)參數(shù)，多參數(shù)模型的診斷效能明顯高于各單因素參數(shù)，為Ki67表達(dá)狀態(tài)的無(wú)創(chuàng)診斷提供新思路。