楊婧 王婷 祝阿妮

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病[1-2]。這種氣道炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，故支氣管哮喘常出現(xiàn)廣泛、多變的可逆性呼氣氣流受限，患者反復(fù)發(fā)作喘息、胸悶、咳嗽等癥狀，若診療不規(guī)范，癥狀控制不佳，會嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3]。IL-6作為IL家族中常見的一員，是由免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌的小分子糖蛋白(21 kDa)[4]，其釋放常由細(xì)胞應(yīng)激或損傷因素觸發(fā)，如紫外線、輻射等。IL-6也因在多種炎性疾病中高表達(dá)，故一直以來被認(rèn)為是炎癥的一個常見標(biāo)記物[5]。既往研究也發(fā)現(xiàn)IL-6在哮喘患者血清中高表達(dá)。本研究納入處于不同控制水平的支氣管哮喘患者，測定并對比誘導(dǎo)痰IL-6的表達(dá)水平，探究哮喘控制水平、FEV1值與誘導(dǎo)痰IL-6表達(dá)水平的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對象

研究納入了2019年1月至2020年12月就診于我院門診的哮喘患者159例，其中哮喘控制良好組患者42例，哮喘部分控制組患者49例，哮喘未控制組患者68例。研究前納入的病例中排除了12例中重度及8例危重度哮喘患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷標(biāo)準(zhǔn)參考第九版內(nèi)科學(xué)哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)：① 反復(fù)發(fā)作性喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽，多與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理、化學(xué)性刺激、病毒性上呼吸道感染、運(yùn)動，有關(guān)。② 發(fā)作時在雙肺可聞及散在或彌漫性以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長。③ 上述癥狀可經(jīng)治療緩解或自行緩解。④ 癥狀不典型者(如無明顯喘息或體癥)至少以下一項試驗陽性：支氣管舒張試驗陽性；支氣管激發(fā)試驗或運(yùn)動試驗陽性；最大呼氣量(PEF)日內(nèi)變異率或晝夜波動率≥20%.⑤ 除外其他疾病引起的喘息、胸悶、咳嗽，如慢性支氣管炎、阻塞性肺氣腫、支氣管擴(kuò)張、肺間質(zhì)纖維化、急性左心衰等。哮喘控制水平分級，參照第九版內(nèi)科學(xué)哮喘癥狀控制水平表。過去四周，病人存在以下四條中的3-4項定義為未控制：① 日間哮喘癥狀>2次/周；② 夜間因哮喘憋醒；③ 使用緩解藥次數(shù)>2次/周；④ 哮喘引起的活動受限。若出現(xiàn)1-2項定義為部分控制，若無上述癥狀定義為良好控制。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 中重度及危重度哮喘患者。哮喘急性發(fā)作時嚴(yán)重程度分級參考第9版內(nèi)科學(xué)，主要依據(jù)患者癥狀(氣短程度、講話是否有中斷等)、體征(三凹征、奇脈等)及血氣分析、肺功能檢查等指標(biāo)。② FEV1/預(yù)計值 < 50%。③ 近期大咯血患者。④ 呼吸衰竭。⑤ 氣胸或縱隔氣腫。⑥合并胸腔積液或心包積液。⑦嚴(yán)重心功能不全。⑧活動性肺結(jié)核。納入及排除流程圖(如圖1)所示?；颊叩囊话阈畔⑷缧詣e、年齡、肺功能檢查結(jié)果等數(shù)據(jù)來源于門診或住院病歷。研究所有參與者均被告知實驗的研究目的及確切的實驗程序。

圖1 患者納入及排除流程圖

二、誘導(dǎo)痰法

在接受誘導(dǎo)痰前30分鐘，所有患者均吸入200 ug沙丁胺醇，15分鐘后，完成吸入支氣管擴(kuò)張劑后，肺功能檢查。然后，每位患者均在室溫下使用超聲霧化器吸入無菌高滲性生理鹽水，共吸入3次，濃度遞增，分別為3%，4%和5%，每次吸入持續(xù)時間為5分鐘，在咳出足夠數(shù)量的痰(2 mL)后停止誘導(dǎo)。每次吸入后均測定患者FEV1水平，整個誘導(dǎo)痰過程順利，未出現(xiàn)患者FEV1下降超過10%的情況。

痰液收集好后立即置于EP管中封存，稱重，記錄每管中痰液的重量和體積。在每例標(biāo)本中均加入2倍痰重量的0.1% DTT溶液(德國merck)，后將混合物離心(1 000 rpm，15 min)。隨后在每例標(biāo)本中加入2倍痰體積的PBS溶液，再次將混合物離心(800 rpm，5 min)。收集上清液，儲存于-80 ℃冰箱保存。誘導(dǎo)痰合格標(biāo)準(zhǔn)為：體積至少2 mL，上皮細(xì)胞小于50%，非上皮細(xì)胞大于200個。

測定IL-6時，受限進(jìn)行標(biāo)本分裝，每個EP管留存100 ul痰標(biāo)本。使用ELISA試劑盒(Abcam中國，ab178013)對每例標(biāo)本進(jìn)行IL-6表達(dá)值測定，所有步驟嚴(yán)格按照說明書操作。每例標(biāo)本設(shè)有2組對照，試劑盒測試靈敏度為1.6 pg/mL，測定范圍為7.8～500 pg/mL。

三、數(shù)據(jù)處理

采用Excel表格記錄數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)；計量資料，如年齡、IL-6表達(dá)值、FEV1值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對于符合正態(tài)分布的計量資料，采用單因素方差分析三組數(shù)據(jù)差異，進(jìn)行兩兩組間比較時，使用單因素方差分析LSD進(jìn)行多重檢驗比較；計數(shù)資料，如性別，以例數(shù)和百分比(%)表示，采用四格表卡方檢驗比較兩組數(shù)據(jù)差異。在四格表中，若預(yù)期病例很少(<1)，則使用Fisher精確分析法分析。對于不符合正態(tài)分布的資料，采用秩和檢驗分析數(shù)據(jù)。以P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。使用GraphPad prism 8.0繪制每組IL-6表達(dá)值的散點圖、進(jìn)行每組內(nèi)FEV1與IL-6表達(dá)水平一元線性相關(guān)分析、繪制線形圖。

結(jié) 果

一、一般信息

三組哮喘患者的一般信息由(表1)列出。在哮喘控制良好組，男性23例，女性19例；哮喘部分控制組，男性26例，女性23例；哮喘未控制組，男性36例，女性32例，三組在性別分布上無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。三組平均年齡分別為(45.88±13.21)歲、(49.79±11.87)歲和(45.88±13.21)歲，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。從三組患者統(tǒng)計的肺功能指標(biāo)上來看，F(xiàn)EV1值、FEV1%預(yù)計值、FEV1/FVC比值在哮喘控制良好組最高，哮喘部分控制組次之，哮喘未控制組最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(見表1)。

表1 三組哮喘患者的一般信息

二、三組哮喘患者誘導(dǎo)痰中IL-6表達(dá)情況

如表2所示，處于哮喘良好控制水平組患者誘導(dǎo)痰中IL-6表達(dá)值為(17.8±1.5)pg/mL，低于處于哮喘部分控制水平組患者(30.2±1.7)pg/mL和哮喘未控制水平組患者表達(dá)值(32.3±1.5)pg/mL。兩兩對比后發(fā)現(xiàn)，后兩組表達(dá)值無統(tǒng)計學(xué)差異。三組IL-6表達(dá)值繪制的散點圖(如圖2)所示。

表2 三組哮喘患者誘導(dǎo)痰IL-6表達(dá)水平

圖2 三組哮喘患者誘導(dǎo)痰IL-6表達(dá)水平散點圖

三、肺功能(FEV1、FEV1%預(yù)計值、FEV1/FVC)與誘導(dǎo)痰中IL-6表達(dá)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析可見(如圖3)。在每組中，F(xiàn)EV1、FEV1%預(yù)計值、FEV1/FVC與誘導(dǎo)痰IL-6水均呈負(fù)相關(guān)，即誘導(dǎo)痰IL-6水平越高的患者FEV1、FEV1%預(yù)計值、FEV1/FVC值越低。

圖3 各組FEV1、FEV1%預(yù)計值、FEV1/FVC 與誘導(dǎo)痰IL-6表達(dá)水平線性相關(guān)圖。

討 論

支氣管哮喘(哮喘)是一種慢性非特異性炎癥性氣道疾病，伴有氣道黏膜中多種炎性細(xì)胞浸潤以及促炎細(xì)胞因子和脂質(zhì)介質(zhì)釋放。因哮喘的炎癥反應(yīng)涉及多種不同的特異性免疫細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞，故哮喘存在疾病異質(zhì)性[6]。大多數(shù)哮喘患者包括至少50%重癥哮喘患者為2型氣道炎癥。2型氣道炎癥通常表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞或FeNO升高，或可能伴有特異性(IgE升高)[7]，對吸入性激素反應(yīng)良好，但重癥哮喘對高劑量吸入性激素未必有效，因口服激素副作用大，故對于此類患者，針對IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子及IgE為靶向的精準(zhǔn)醫(yī)療，顯得尤為重要[8]。

IL-6是由免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的小分子糖蛋白，是白介素家族中重要的一員。IL-6長期以來一直被認(rèn)為和TNFα、IL-1β一樣，是炎癥的重要標(biāo)記物。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，IL-6不僅是促進(jìn)炎癥反應(yīng)的因子，而且也是包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的某些疾病的致病因素，故而已成為治療某些疾病的靶點[9]。在哮喘的相關(guān)研究中，IL-6被證實在患者的血清中表達(dá)升高。與穩(wěn)定期哮喘患者、健康的非吸煙者及接受機(jī)械通氣的非哮喘患者相比，“活動性”的哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中的IL-6表達(dá)水平升高，提示IL-6可能參與哮喘的急性發(fā)作[10]。在我們的研究中，經(jīng)測定誘導(dǎo)痰中IL-6的表達(dá)值后發(fā)現(xiàn)，與哮喘控制良好組患者相比，哮喘部分控制組和哮喘未控制組患者誘導(dǎo)痰IL-6表達(dá)值明顯升高，這一結(jié)果也證實IL-6參與哮喘的“活動”。Zala Jevnikar等學(xué)者研究測定了18例輕中癥哮喘患者(實驗組)和16例健康者(對照組)誘導(dǎo)痰中幾種炎癥因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：IL-6在實驗組中表達(dá)升高，而IL-4、IL-5表達(dá)在兩組無明顯差異，這提示可能存在除炎癥細(xì)胞之外的其他促進(jìn)IL-6分泌的細(xì)胞存在[11]。有研究證實，哮喘患者(成人和兒童)支氣管上皮細(xì)胞中IL-6過度表達(dá)，裸鼠肺上皮細(xì)胞存在IL-6基因持續(xù)表達(dá)，若裸鼠暴露于過敏原，則IL-6基因則被激活表達(dá)，故IL-6在處于未控制水平的哮喘患者中高表達(dá)，可能不是持續(xù)炎癥反應(yīng)的結(jié)果，而是肺上皮細(xì)胞暴露于過敏原而被“激活”有關(guān)[12-13]。

我們的研究進(jìn)一步統(tǒng)計，分析了每組中患者肺功能水平與誘導(dǎo)痰IL-6表達(dá)值相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在每組中，F(xiàn)EV1、FEV1%預(yù)計值、FEV1/FVC與誘導(dǎo)痰IL-6水平均呈負(fù)相關(guān)，即誘導(dǎo)痰IL-6水平越高的患者FEV1、FEV1%預(yù)計值、FEV1/FVC值越低，P<0.05。在Zala Jevnikar等學(xué)者研究中，在輕中癥哮喘患者中，誘導(dǎo)痰IL-6水平與FEV1/FVC%預(yù)計值呈負(fù)相關(guān)[11]。在Turan等人的研究中，哮喘患者IL-6水平與FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，雖然P值>0.05，但也與FEV1%預(yù)計值有負(fù)相關(guān)趨勢，均與我們的研究結(jié)果有一致性[14]。除了調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞功能外，IL-6還被證實可以有促進(jìn)氣道壁增厚、上皮下纖維化、平滑肌細(xì)胞肥大和增殖的功能，IL-6可能通過上述功能介導(dǎo)氣道重塑影響肺生理學(xué)功能[15-16]。

我們的研究證實哮喘患者誘導(dǎo)痰IL-6水平升高可能提示患者哮喘控制不佳，肺功能下降，IL-6以后期望成為哮喘治療的生物學(xué)靶點。