段悅慶 柯舒文 楊 華 唐 標(biāo) 劉月環(huán),2

(1.杭州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310053)(2.杭州醫(yī)學(xué)院 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310013) (3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所,杭州 310021)

多黏菌素因其高發(fā)腎毒和神經(jīng)毒性[1]曾在臨床上被棄用，近年來(lái)又成為治療多重耐藥的革蘭陰性菌。Mcr-1是存在于大腸桿菌的一種質(zhì)粒攜帶的多黏菌素耐藥基因，2016年首次發(fā)現(xiàn)于中國(guó)[2]，存在于不同的菌屬中[3]。動(dòng)物性食品、環(huán)境和人體皆可以作為轉(zhuǎn)移耐藥基因的宿主[4-6]。日趨嚴(yán)峻的多重耐藥與超級(jí)細(xì)菌嚴(yán)重威脅著人類健康,研發(fā)快速、高效的檢測(cè)方法顯得尤為緊迫。目前該領(lǐng)域的檢測(cè)方法除了肉湯微量稀釋法外，均是針對(duì)mcr耐藥基因的PCR檢測(cè)方法[7-11]，對(duì)專業(yè)技能要求高、耗時(shí)長(zhǎng)、需要專用PCR儀等缺點(diǎn)限制了臨床推廣。

多黏菌素耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制提示細(xì)胞壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)中的脂質(zhì)A受到mcr-1的修飾，產(chǎn)生磷酸乙醇胺基團(tuán)，使得細(xì)菌表面負(fù)電荷減少，導(dǎo)致多黏菌素與LPS減少互作，從而產(chǎn)生了耐藥性[12]。炎性反應(yīng)研究表明，體內(nèi)LPS與其受體結(jié)合后引起TLR4通路的改變以調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸[13]，基于上述啟發(fā)，結(jié)合LBP、TLR4、CD14和SR-IIA的氨基酸序列，本研究分析了脂質(zhì)A的結(jié)合肽序列獲得了相應(yīng)的MOTIF，根據(jù)這個(gè)MOTIF設(shè)計(jì)出能與LPS結(jié)合的小肽，建立了基于小肽的夾芯式ELISA檢測(cè)法，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

酶標(biāo)儀(SpectraMax M4,MolecularDevices公司)，分析天平(MSE2258-00TU,Sartorius公司)，多功能空氣振蕩器(HZY-124/223，華志公司)，生化培養(yǎng)箱(SPX-250，常州偉嘉)。

多黏菌素耐藥性的陰性對(duì)照菌株來(lái)源于浙江工業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。陽(yáng)性對(duì)照菌為含mcr-1基因的大腸桿菌株均來(lái)自浙江省農(nóng)科院。野外(大田)樣品來(lái)自浙江省內(nèi)不同地區(qū)，土壤3份、自來(lái)水泥水1份及河水樣1份，共5份隨機(jī)取自浙江省兩個(gè)市的1區(qū)4縣，專業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)樣品隨機(jī)取自浙江省某鴨場(chǎng)土樣1份，雞場(chǎng)糞樣2份，豬場(chǎng)泥水樣1份。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)樣品包括用于制備動(dòng)物模型的高脂飼料原料蛋黃粉(EYP)4份，屏障系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物過濾飲用水5份，上述樣品均采于省內(nèi)某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)基地。菌種和制備完畢的大田樣品均保存于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陰、陽(yáng)性對(duì)照菌用指數(shù)期菌，用前在LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)4 h或過夜，野外(大田)樣采用0.9%氯化鈉溶液稀釋法來(lái)制備，最大程度體現(xiàn)了取樣現(xiàn)場(chǎng)多黏菌素抗性的原始狀態(tài)。

1.2 小肽的設(shè)計(jì)、合成與工作濃度的確定

篩選分析LPS受體復(fù)合物序列及空間結(jié)構(gòu)獲得其MOTIF序列：XSS/FS/FISSXRAC，對(duì)其進(jìn)行分析后設(shè)計(jì)出能識(shí)別LPS的肽段，并將肽段優(yōu)化為9～13個(gè)氨基酸的小肽，使其適用于制成檢測(cè)大腸桿菌菌體的抗原，小肽由南京金斯瑞公司人工合成。小肽包被起始濃度為4 μg/mL，2 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.25 μg/mL(250 ng/mL)，0.13 μg/ml(125 ng/mL)，0.06 μg/mL(62.5 ng/mL)，0.03 μg/mL(32.25 ng/mL)，已知陰陽(yáng)性的指數(shù)菌250倍稀釋后為待檢樣品，商品化的脂質(zhì)A鼠抗體為一抗(1∶100)(ABCAM ab8467)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)(杭州華安 HA1006)，建立ELISA體系。

1.3 耐多黏菌素E.coli的ELISA法檢測(cè)體系確立及試劑盒的研究

在對(duì)抗原小肽，待檢樣本，阻斷液(過氧化氫)，一抗，二抗，顯色液，終止液的合適工作濃度逐一進(jìn)行摸索后，獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的以小肽為基礎(chǔ)的耐多黏菌素E.coli的ELISA法檢測(cè)體系及試劑盒。

1.4 試劑盒的檢測(cè)步驟與說(shuō)明

檢測(cè)步驟：按常規(guī)ELISA法[14]操作如下：加樣(250倍指數(shù)菌100 μL)→孵板，洗滌→加入一抗(生物素標(biāo)記的13小肽，1∶1 000)→孵板，洗滌→加入二抗(1∶2 500～5 000)→孵板洗滌→加入底物顯色液→終止，讀A值。結(jié)果判斷，A值<0.3為陰性，>0.4為陽(yáng)性，范圍在0.3～0.4，則應(yīng)重復(fù)檢測(cè)1～3次，若A值均值/陰性孔的A值均值大于2.1均判為陽(yáng)性，小于2.1判為陰性。

1.5 PCR法作為對(duì)ELISA法的準(zhǔn)確性參照

在檢測(cè)體系建立的過程中，以mcr-1的PCR對(duì)間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校核，既是確定檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的措施，又是試劑盒質(zhì)控過程的重要步驟。本實(shí)驗(yàn)PCR檢測(cè)方法按參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩種方法相符。結(jié)果也在本研究試劑盒敏感性中體現(xiàn)。

1.6 培養(yǎng)法測(cè)定最低檢出量的限值

將待檢樣品倍比稀釋(先按檢測(cè)方法250倍作為一個(gè)檢測(cè)樣，再按1 000倍，100萬(wàn)倍這樣稀釋作為一個(gè)檢測(cè)樣)后，取稀釋液2 μL涂于LB固體培養(yǎng)基，測(cè)出CFU值，然后用ELISA法測(cè)出稀釋液的A值，確定最大稀釋倍數(shù)與A值對(duì)應(yīng)關(guān)系，即CFU為0時(shí)的A值。多黏菌素選擇性培養(yǎng)基中黏菌素終濃度為4 μg/mL。

1.7 試劑盒的質(zhì)控

在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上組裝檢測(cè)試劑盒，同時(shí)擴(kuò)大樣本種類、含量，就檢測(cè)試劑盒的精密性、特異性、敏感性、重復(fù)性進(jìn)行測(cè)試與優(yōu)化，形成可以用的產(chǎn)品(含說(shuō)明書)。

1.7.1敏感性：將已知多黏菌素耐藥陰性(5份)與陽(yáng)性(3份)的菌株從1∶50起連續(xù)倍比稀釋至第8孔(1∶390 725)，倍差為5倍，采用多黏菌素耐藥的大腸桿菌夾芯ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)上述稀釋后的樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到A值數(shù)據(jù)，然后就以相應(yīng)稀釋度的待檢液作為模板，裂解后用PCR法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.7.2特異性：取多黏菌素耐藥陰性(含LPS、血清、載體、BSA、β-actin、Marker、酪蛋白、甘氨酸、水、TAE緩沖液等)的大腸桿菌菌株培養(yǎng)液，用小肽包被的ELISA法(1∶250)進(jìn)行測(cè)定，然后將此菌株做藥敏或PCR實(shí)驗(yàn)，將二者結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算陰性與陽(yáng)性的檢出率及兩種方法的符合率。

1.7.3精密性：取陰陽(yáng)性樣品各一份，1∶250倍稀釋后，各用半塊(6條)小肽包被的96孔板測(cè)定，得到的結(jié)果分別計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算板內(nèi)變異系數(shù)，變異系數(shù)小于9，即為精密性合格。

1.7.4重復(fù)性：取多黏菌素耐藥陽(yáng)性陰性的菌株樣品，每個(gè)樣品用小肽包被的板連續(xù)測(cè)定8遍，觀察8次檢測(cè)結(jié)果的平均值，如果平均符合陰陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，則判為重復(fù)性符合預(yù)期。

1.8 試劑盒的使用效果

收集各種環(huán)境下已知陰陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的指數(shù)期菌69份，野外(大田)樣品6份，蛋黃粉樣品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水樣品9份，用本試劑盒按1.4步驟進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)樣本量

檢測(cè)樣本包括10份陽(yáng)性菌、6份陰性菌、5份野外(大田)樣品、4份蛋黃粉(EYP) 以及5份來(lái)自屏障系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物過濾飲用水(Water),各樣品使用量見表1。

表1 抗多黏菌素大腸桿菌ELISA法檢測(cè)樣本數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Samples by polymyxin- resistance E. coli ELISA

2.2 小肽的工作濃度

第一輪ELISA，脂質(zhì)A鼠抗體為一抗(1∶100)(ABCAM ab8467)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)(杭州華安 HA1006)用于確定小肽的工作濃度(含用作抗原的小肽和用生物素標(biāo)記的小肽的工作濃度)，測(cè)出A值，根據(jù)ELISA法的方陣滴定法的經(jīng)驗(yàn)，A值為1.0左右時(shí)定為合適的小肽工作濃度對(duì)應(yīng)值，其對(duì)應(yīng)的小肽工作濃度為2 ng/μL，將之用于夾芯ELISA法包被的抗原預(yù)包被于96孔板，成為ELISA法中的酶標(biāo)板?？乖_定為9肽，一抗確定為13肽后進(jìn)行生物素標(biāo)記，其后工作濃度確定為1∶1 000，二抗系商品化HRP標(biāo)記的鏈霉親和素(說(shuō)明書的工作濃度為1∶2 000～100 000)。

2.3 試劑盒的組裝

試劑盒組成：96孔小肽包被的ELISA板一塊；阻斷液1瓶，一抗1瓶，生物素標(biāo)記的13肽、二抗1瓶；HRP底物液二瓶，終止液1瓶，陰性對(duì)照一瓶，陽(yáng)性對(duì)照一瓶，空白對(duì)照一瓶，20倍濃縮洗液1瓶。

2.4 培養(yǎng)法測(cè)定最低檢出量的限值

在ELISA法A值區(qū)分為陽(yáng)性(大于0.4)和陰性(小于0.3)的情況下，9個(gè)大田樣品經(jīng)培養(yǎng)(微量肉湯稀釋法)涂板后觀察到的最大檢出限值為3×103個(gè)CFU/mL，最小的檢出限值為1.5×103個(gè)CFU/mL，經(jīng)過多黏菌素選擇性培養(yǎng)基涂布法檢出限為0～2.5×103個(gè)CFU/mL。

2.5 試劑盒的質(zhì)控結(jié)果

5份陽(yáng)性樣品A值均在1∶50～1∶156 250(第1孔到第6孔)的稀釋倍數(shù)之間，敏感性符合率100%，10份多黏菌素耐藥陰性(含LPS，血清，載體，BSA，β-actin，Marker，酪蛋白，甘氨酸，水，TAE緩沖液等)的大腸桿菌菌株培養(yǎng)液各待檢樣品均呈陰性，試劑盒特異性良好。陰性樣品與陽(yáng)性樣品各1份經(jīng)過250倍稀釋后進(jìn)行了精密性測(cè)試，得出的變異系數(shù)符合小于9的預(yù)期。用小肽包被的板對(duì)多黏菌素耐藥陽(yáng)性6份與5份陰性的菌株樣品加樣后，每個(gè)樣品連續(xù)測(cè)定8遍，計(jì)算平均值，陰陽(yáng)性組結(jié)果符合預(yù)期，重復(fù)性良好。

兩種方法相比較得出，ELISA法A值大于0.4 時(shí)對(duì)應(yīng)于圖1中的B～F，均擴(kuò)增出了1 626 bp的產(chǎn)物，而G，H沒有條帶，可能是由于稀釋度太大，即稀釋度大于1∶312 50的指數(shù)菌用本實(shí)驗(yàn) 的ELISA法就無(wú)法檢出了，這完全滿足了檢驗(yàn)下限的需求。

2.6 試劑盒的試用效果

48份陽(yáng)性菌及21份陰性工程菌的檢測(cè)結(jié)果中，陽(yáng)性菌均被檢出，陰性菌均未被檢出。6份不同性質(zhì)的野外樣品僅糞樣為陽(yáng)性，其余為陰性。9份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)的樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

注：A和T.DNA Marker；B—S.多黏菌素耐藥陽(yáng)性菌從原液開始連續(xù)做1∶50稀釋后的PCR結(jié)果Note：A and T.DNA Marker；B—S.PCR of polymyxin-resistant E.coli diluted continuously for 1∶50 from exponential phases圖1 ELISA敏感性檢測(cè)中的樣品1各稀釋度用PCR法擴(kuò)增mcr-1 基因的結(jié)果Fig.1 Dilution of sample 1 detected by mcr-1 gene PCR in ELISA sensitivity test

3 討論

目前新型耐藥性檢測(cè)都是針對(duì)mcr-1及其同族基因的PCR法，雖有高度特異性、敏感性等優(yōu)點(diǎn)，但因其專業(yè)技能要求高、耗時(shí)長(zhǎng)等要求，不易短時(shí)間內(nèi)大眾化推廣；環(huán)介導(dǎo)的快速擴(kuò)增目測(cè)法(LAMP)相比PCR法靈敏度更高、操作簡(jiǎn)單耗時(shí)更短，但易造成氣溶膠污染[16]。微量肉湯稀釋法及藥敏檢測(cè)因定性定量，可重復(fù)性好，不需昂貴設(shè)備而成為耐藥檢測(cè)領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)[17-19]。但這些方法在臨床應(yīng)用時(shí)則因?yàn)樾枰^長(zhǎng)的孵育時(shí)間而導(dǎo)致不能及時(shí)指導(dǎo)抗感染治療，在野外環(huán)境下則沒有可用的儀器或檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)而導(dǎo)致使用范圍受限[20-21]。

本研究中建立的針對(duì)多黏菌素耐藥的大腸桿菌的夾芯ELISA檢測(cè)方法在敏感性、特異性、精密性和重復(fù)性上面均達(dá)到了滿意的效果，初步應(yīng)用檢測(cè)的樣本均達(dá)到了滿意的效果。本次對(duì)高脂模型飼料原料——蛋黃粉及屏障系統(tǒng)動(dòng)物飲用水的陰性檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)微生物等級(jí)的嚴(yán)格控制使得耐藥性的傳播在一定程度上得以阻斷。另外，本研究使得檢測(cè)方法從核酸水平重回蛋白水平，檢出效率大大提高，檢測(cè)工作從復(fù)雜變?yōu)楹?jiǎn)單，試劑都是常見成分，成本低，為今后的標(biāo)準(zhǔn)化、智能化檢測(cè)技術(shù)的全面鋪開提供了基礎(chǔ)，為多黏菌素的減量[22]使用與耐藥性治理提供了技術(shù)支撐。