程琳 張剛

結(jié)腸癌已成為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年導(dǎo)致大量與癌癥相關(guān)的患者死亡[1]。由于結(jié)腸切除術(shù)、化學(xué)療法和免疫療法等治療方法的改進(jìn)，結(jié)腸癌患者總體5年相對(duì)生存率約為64%[2]。然而，晚期、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性結(jié)腸癌患者的預(yù)后仍然很差。因此，迫切需要探索結(jié)腸癌進(jìn)展的其他未知機(jī)制，并開(kāi)發(fā)治療新策略。蘆筍是一種多年生植物，具有顯著抗真菌、抗肝毒性、細(xì)胞毒性、抗誘變、抗炎和利尿特性[3]。蘆筍富含多種生物活性植物化學(xué)物質(zhì)，已被用于治療各種慢性炎癥疾病和癌癥[4,5]。根據(jù)報(bào)道，從蘆筍中提取的蘆筍皂苷對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)具有潛在的抑制活性[6]。蘆筍提取物對(duì)結(jié)腸癌具有良好的細(xì)胞毒性作用[7]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類(lèi)由上游剪接受體和下游剪接供體組成的環(huán)狀RNA分子，在真核生物中廣泛傳播[8]。最近的研究揭示了circRNA充當(dāng)微小RNA(MicroRNA，miRNA)海綿與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)[9]。在膀胱癌[10]、肝癌[11]中發(fā)現(xiàn)circ_0001361上調(diào)，它可能作為膀胱癌、肝癌治療的靶點(diǎn)。本研究評(píng)估蘆筍皂苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及circ_0001361表達(dá)的影響，旨在探討蘆筍皂苷對(duì)結(jié)腸癌的抗癌功能與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，si-NC、si-circ_0001361、pcDNA、pcDNA-circ_0001361、miR-136模擬物、模擬物NC(miR-NC)(上海吉瑪)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(日本Dojindo)，兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體、B兔抗人cl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(美國(guó)Abcam)，RIPA裂解緩沖液(江蘇Beyotime)，膜聯(lián)蛋白 V(Annexin V)-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Clontech Laboratories)，ECL蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑(美國(guó)GE Healthcare)，pmirGLO載體(美國(guó)Promega)，Trizol試劑(北京Solarbio)，特異性逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix(南京Vazyme)，乙醇、甲醇等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。蘆筍皂苷：新鮮蘆筍(武漢新辰食品有限公司)于60℃烘干并粉碎成粉末，以1∶15的料液比加入74%乙醇，在50℃下超聲提取54 min，過(guò)濾用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，以甲醇定容至100 ml備用[12]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SW1116細(xì)胞在飽和濕潤(rùn)、5% CO2和37℃條件的培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將SW1116細(xì)胞分為對(duì)照組、蘆筍皂苷L、M、H組、si-NC組、si-circ_0001361組、蘆筍皂苷H+pcDNA組、蘆筍皂苷H+pcDNA-circ_0001361組。對(duì)照組SW1116細(xì)胞未作任何處理，蘆筍皂苷L、M、H組的蘆筍皂苷濃度分別為45、90、180 mg/L[13]，作用時(shí)間為48 h。si-NC組、si-circ_0001361組、蘆筍皂苷H+pcDNA組、蘆筍皂苷H+pcDNA-circ_0001361組的SW1116細(xì)胞以1×105/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)匯合度至60%左右，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑操作指示，分別進(jìn)行si-NC、si-circ_0001361、pcDNA、pcDNA-circ_0001361轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，根據(jù)分組將轉(zhuǎn)染基質(zhì)更換為不含或含180 mg/L蘆筍皂苷的新鮮培養(yǎng)基，保持48 h。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將SW1116細(xì)胞(1×104個(gè)細(xì)胞)接種在96孔板中24 h。然后根據(jù)1.3 實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理。向每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8，持續(xù)2 h。使用酶標(biāo)儀在每個(gè)孔中測(cè)定450 nm處的吸光度OD值，以(100%-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%計(jì)算抑制率(%)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 根據(jù)Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明指示，每組SW1116細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞)懸浮在結(jié)合緩沖液中，用Annexin V-FITC(5 μl)和碘化丙錠(propidium iodide，PI)(5 μl)在室溫下黑暗中染色15 min。孵育后，在配備有CellQuest軟件的Becton Dickinson FACScan流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm)中分析細(xì)胞。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成 將每組SW1116細(xì)胞接種在6孔板(500個(gè)細(xì)胞/孔)中，連續(xù)培養(yǎng)14 d，隨后，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下克隆數(shù)。

1.7 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 在含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中收集每組SW1116細(xì)胞總蛋白質(zhì)。取20 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白封閉后，1∶1 000稀釋的Bax、Bcl-2和GAPDH與膜在4℃下共培養(yǎng)過(guò)夜。與羊抗兔二抗在室溫下共培養(yǎng)1 h。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液可視化蛋白印跡。使用Image Lab軟件量化Bax、Bcl-2相對(duì)于GAPDH的表達(dá)。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)circ_0001361和miR-136表達(dá) 使用Trizol試劑分離每組SW1116細(xì)胞RNA后，利用特異性逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。然后，通過(guò)SYBR Green PCR Master Mix監(jiān)測(cè)RNA水平，并使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行量化。以β-actin或U6作為內(nèi)部對(duì)照。引物序列(5’-3’)為：circ_0001361-F CCCACTTGGTGAATGG AGAT，circ_0001361-R GGATTTGGTCGGTCATCATC。

β-actin-F TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC，β-actin-R ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG。miR-136-F ACACTC CAGCTGGGACTCCATTTGTTTT，miR-136-R CCAGTGC AGGGTCCGAGGT，U6-F CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-R AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.9 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) miR-136與circ_0001361之間的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)軟件Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)。將含有miR-136預(yù)測(cè)或突變結(jié)合位點(diǎn)的circ_0001361序列插入pmirGLO載體，生成circ_0001361野生型(WT)或突變體(MUT)。將circ_0001361(WT/MUT)以及miR-136模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞。在Dual-Lucy Assay系統(tǒng)中評(píng)估轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞的熒光素酶活性。另將pcDNA-circ_0001361、pcDNA轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞，48 h后以qRT-PCR評(píng)估m(xù)iR-136表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 蘆筍皂苷對(duì)SW1116增殖凋亡的影響 與對(duì)照組比較，蘆筍皂苷L組、蘆筍皂苷M組、蘆筍皂苷H組SW1116細(xì)胞的抑制率、凋亡率逐漸增加，克隆數(shù)逐漸減少，Bax蛋白表達(dá)量遞增，Bcl-2蛋白表達(dá)量遞減(P<0.05)，且蘆筍皂苷L組、M組、H組3組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

表1 蘆筍皂苷對(duì)SW1116增殖凋亡

2.2 蘆筍皂苷對(duì)SW1116中circ_0001361和miR-136表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，蘆筍皂苷L組、蘆筍皂苷M組、蘆筍皂苷H組SW1116細(xì)胞的circ_0001361表達(dá)量依次降低，miR-136表達(dá)量依次升高(P<0.05)，蘆筍皂苷L組、蘆筍皂苷M組、蘆筍皂苷H組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 蘆筍皂苷對(duì)SW1116中circ_0001361和miR-136表達(dá)

2.3 抑制circ_0001361對(duì)SW1116增殖凋亡的影響 抑制circ_0001361后，si-circ_0001361組SW1116細(xì)胞中circ_0001361的表達(dá)量比si-NC組減少0.77倍左右，細(xì)胞抑制率、凋亡率比si-NC組增加，克隆數(shù)、Bcl-2蛋白表達(dá)量較si-NC組降低，Bax蛋白表達(dá)量較si-NC組升高(均P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 抑制circ_0001361對(duì)SW1116增殖凋亡

圖2 抑制circ_0001361對(duì)SW1116凋亡的影響；A 流式細(xì)胞圖；B Wester blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量

2.4 circ_0001361靶向調(diào)控miR-136 在Circular RNA Interactome軟件中預(yù)測(cè)到的circ_0001361和miR-136互補(bǔ)序列。circ_0001361(WT)的熒光素酶活性在miR-136組中顯著低于miR-NC組(P<0.05)，circ_0001361(MUT)的熒光素酶活性在miR-136組與miR-NC組中無(wú)明顯差別(P=0.512)。si-circ_0001361組SW1116細(xì)胞中miR-136表達(dá)量為(2.74±0.09)高于si-NC組的(1.00±0.00)(t=58.000，P<0.05)，pcDNA-circ_0001361組miR-136表達(dá)量為(0.47±0.05)低于pcDNA組的(1.00±0.00)(t=31.800，P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 circ_0001361和miR-136的互補(bǔ)序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 circ_0001361對(duì)蘆筍皂苷處理的SW1116增殖凋亡的影響 蘆筍皂苷H+pcDNA-circ_0001361組SW1116細(xì)胞中circ_0001361的表達(dá)量比蘆筍皂苷H+pcDNA組增加3.45倍左右，細(xì)胞抑制率、凋亡率低于蘆筍皂苷H+pcDNA組，克隆數(shù)、Bcl-2蛋白表達(dá)量高于蘆筍皂苷H+pcDNA組，Bax蛋白表達(dá)量低于蘆筍皂苷H+pcDNA組(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表5。

圖4 circ_0001361對(duì)蘆筍皂苷處理的SW1116凋亡的影響；A 流式細(xì)胞圖；B Wester blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量

表5 circ_0001361對(duì)蘆筍皂苷處理的SW1116增殖凋亡的檢測(cè)

3 討論

蘆筍是一種廣受歡迎且健康的蔬菜，富含維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和纖維[9]。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，包括蘆筍在內(nèi)的許多膳食天然產(chǎn)品具有抗腫瘤活性[14]。從蘆筍中提取的皂苷類(lèi)化合物可能是其抗腫瘤特性的主要活性成分[15]。據(jù)報(bào)道，蘆筍皂苷在不同的癌細(xì)胞系中顯示出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，例如蘆筍皂苷以劑量依賴(lài)性方式抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并通過(guò)調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(下調(diào)Bcl2、上調(diào)Bax)的表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[16,17]。蘆筍皂苷Asparanin A的給藥抑制了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖，減少腫瘤生長(zhǎng)，并加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18]。此外，蘆筍芽甲醇提取物通過(guò)激活TRAIL細(xì)胞凋亡途徑減少結(jié)腸癌SW480和SW620的細(xì)胞增殖，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。本研究與前述研究一致，證明蘆筍皂苷可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

研究表明，circ_0001361在膀胱癌組織和細(xì)胞系中高水平表達(dá)，并且與病理分級(jí)和肌肉浸潤(rùn)呈正相關(guān)，circ_0001361通過(guò)靶向miR-491-5p/MMP9軸在膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮致癌作用[20]。在肺腺癌組織和細(xì)胞中，circ_0001361上調(diào)；circ_0001361充當(dāng)miR-525-5p的海綿來(lái)上調(diào)下游靶標(biāo)VMA21水平，驅(qū)動(dòng)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[21]。但circ_0001361對(duì)結(jié)腸癌的影響仍未可知。表明抑制circ_0001361抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)凋亡。這表明circ_0001361有助于結(jié)腸癌的腫瘤發(fā)生，這是首次報(bào)道circ_0001361在結(jié)腸癌中的致癌作用。Zhang等[22]利用多組學(xué)揭示幾種中樞miRNA，它們可能對(duì)抗蘆筍皂苷Asparanin A的抗子宮內(nèi)膜癌活性。本研究檢測(cè)到，結(jié)腸癌細(xì)胞中circ_0001361表達(dá)被蘆筍皂苷抑制，miR-136的表達(dá)被蘆筍皂苷促進(jìn)，表示蘆筍皂苷抗癌活性與circ_0001361/miR-136有關(guān)。miR-136作為一種腫瘤抑制因子在結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用[23,24]。此外，miR-136充當(dāng)circ_0109046[25]、circ_0000043[26]在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮功能的重要靶點(diǎn)。本研究中，circ_0001361靶向miR-136，并負(fù)調(diào)控miR-136的表達(dá)。此外，pcDNA-circ_0001361可以逆轉(zhuǎn)蘆筍皂苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。這些表明，蘆筍皂苷通過(guò)下調(diào)circ_0001361并靶向負(fù)調(diào)控miR-136，從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)抗結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的功能。

綜上所述，蘆筍皂苷可以通過(guò)下調(diào)circ_0001361并靶向miR-136，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。蘆筍皂苷可能成為預(yù)防和治療結(jié)腸癌的有效藥物。