趙維波 孔令甲 敬長春

結(jié)直腸癌是常見的死亡癌癥，已成發(fā)展為全球第四致命的癌癥，每年約為90萬人死亡[1]。在我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率均占腫瘤癌癥的第五位，預計至2030年我國結(jié)直腸癌發(fā)病患者將達到40萬例[2]。由于前期缺乏診斷的方法及治療方式，導致5年預后較差[3]。白花丹素化學名為5-羥基-2-甲基-1,4-萘醌，是從藥用植物白花丹根部提取分離而來的，具有抗腫瘤、抗炎等活性[4]。孫瑜針等[5]研究結(jié)果顯示，白花丹素能有效抑制卵巢癌細胞的增殖和誘導細胞的凋亡，但是對結(jié)直腸癌細胞的研究相對較少。鋅指E盒結(jié)合蛋白1(ZEB1)在胚胎轉(zhuǎn)移分化中起到重要的作用，隨著近年研究的不斷深入，其具有致癌作用，在胃癌、乳腺癌等高表達，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[6,7]。鐘軒等[8]研究結(jié)果顯示，干擾ZEB1基因的表達能抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并促進細胞的凋亡。本研究體外培養(yǎng)結(jié)腸腺癌細胞SW480，探討白花丹素是否通過調(diào)控ZEB1的表達影響結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 結(jié)腸腺癌細胞SW480購買于中國科學院上海細胞資源中心；胎牛血清、RMPI-1640培養(yǎng)基購買于美國Hyclone公司；白花丹素購買于上海博麥德生物，純度≥98%；Lipofectamine 2000試劑盒購買于美國Invitrogen公司；si-NC、si-ZEB1、vector、ZEB1由上海吉瑪公司設計合成；MTT試劑盒、凋亡試劑盒購買于北京索萊寶公司；Ki67抗體、p21抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、ZEB1抗體、GAPDH抗體購買于美國Abcam公司；BCA試劑盒、化學發(fā)光試劑購買于碧云天生物；HRP標記的IgG購買于北京中杉金橋生物。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 SW480細胞常規(guī)復蘇后，在含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液，待細胞生長至85%時，進行消化傳代培養(yǎng)。收集處于對數(shù)生長期的SW480細胞懸液，調(diào)整密度為3×104個/ml，接種在24孔板上，采用終濃度為0、1、2、5 μmol/L的白花丹素處理SW480細胞，分為白花丹素0、1、2、5 μmol/L組；按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將si-NC和si-ZEB1轉(zhuǎn)染至SW480細胞，記為si-NC組和si-ZEB1組；將vector和ZEB1轉(zhuǎn)染至SW480細胞后，采用白花丹素濃度為5 μmol/L進行處理，記為白花丹素+vector組和白花丹素+ZEB1組。

1.3 MTT檢測細胞活力 收集各組SW480細胞經(jīng)過消化后，制成單細胞懸液，調(diào)整密度為3×104個/ml接種在96孔板內(nèi)，分別培養(yǎng)48 h后，在每孔內(nèi)加入5 mg/ml的MTT溶液(20 μl)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔內(nèi)加入150 μl二甲基亞砜溶液，使結(jié)晶溶解后，在酶標儀490 nm處檢測各組細胞的吸光度值，并據(jù)此計算細胞活力。細胞活力(%)=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組SW480細胞，加入胰蛋白酶消化，收集細胞并制成細胞懸液，調(diào)整密度為1×105個/ml接種在12孔板內(nèi)，在4℃、1 000 r/min離心10 min棄上清液。根據(jù)凋亡試劑盒說明書將5 μl的Annexin V-FITC及PI溶液與500 μl Binding Buffer混勻，暗室避光反應15 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)。

1.5 Western blot檢測Ki67、p21、Bax、Bcl-2和ZEB1蛋白表達 收集各組SW480細胞經(jīng)過蛋白裂解后，提取各組細胞的總蛋白，按照BCA法檢測定量蛋白濃度，取40 μg經(jīng)過變性的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳處理，分離結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用脫脂奶粉封閉培養(yǎng)1 h，加入Ki67(1∶500)、p21(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)和ZEB1(1∶800)一抗，4℃孵育過夜，加入帶有標記的IgG二抗，37℃孵育1 h。然后加入化學發(fā)光試劑進行顯影、曝光，采用Image Lab軟件分析Ki67、p21、Bax、Bcl-2和ZEB1的蛋白表達，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.6 qRT-PCR檢測ZEB1 mRNA表達 收取各組SW480細胞并添加TRIzol試劑，然后輕輕吹打，提取細胞中總RNA。經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA模板，然后配置擴增反應體系，PCR儀器進行擴增反應。反應條件為95℃15 s; 60℃ 60 s,共40次循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算ZEB1 mRNA表達。ZEB1上游引物5’-ACTGTTTGTAGCGA

CTGGATT-3’，下游引物5’-TAAAGTGGCGGTAGATGG

TA-3’；GAPDH上游引物5’-CGAGCCACATCGCTCAGA

CA-3’，下游引物5’-GTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響 隨著白花丹素濃度的增加，細胞活力顯著降低(P<0.05)，Ki67蛋白表達顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達顯著增加(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響

表1 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響

2.2 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響 隨著白花丹素濃度的增加，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響；A 凋亡圖；B Bax、Bcl-2蛋白表達圖

表2 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響

2.3 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞內(nèi)ZEB1表達的影響 隨著白花丹素濃度的增加，ZEB1 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞內(nèi)ZEB1蛋白表達的影響

表3 不同濃度白花丹素對結(jié)直腸癌細胞內(nèi)ZEB1表達的影響

2.4 干擾ZEB1對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-ZEB1組內(nèi)ZEB1 mRNA和蛋白表達、Ki67蛋白表達顯著降低(P<0.05)，細胞活力顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達顯著增加(P<0.05)。見表4，圖4。

表4 干擾ZEB1對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響

圖4 干擾ZEB1對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響

2.5 干擾ZEB1對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響 與si-NC組比較，si-ZEB1組內(nèi)細胞凋亡率(早期、晚期凋亡)顯著增加，Bax蛋白表達顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表5,圖5。

表5 干擾ZEB1對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響

圖5 干擾ZEB1對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響;A 凋亡圖；B Bax、Bcl-2蛋白表達圖

2.6 白花丹素通過調(diào)控ZEB1的表達對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡的影響 與白花丹素+vector組比較，白花丹素+ZEB1組內(nèi)ZEB1 mRNA和蛋白表達、Ki67、Bcl-2蛋白表達顯著增加(P<0.05)，細胞活力顯著增加(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖6，表6。

圖6 白花丹素通過調(diào)控ZEB1的表達對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡的影響；A 凋亡圖；B Ki67、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達圖

表6 白花丹素通過調(diào)控ZEB1的表達對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡的影響

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)病機制受多種因素的影響，至今尚不明確，臨床治療以手術(shù)切除為主，放療為輔，但是預后效果仍不理想[9]。癌細胞異常增殖和程序性抵抗是導致癌癥發(fā)病的基礎(chǔ)，如何有限抑制結(jié)直腸癌細胞增殖和促進細胞凋亡是其關(guān)鍵所在。白花丹具有多種化學成分，白花丹素是白花丹萘醌類化合物，具有抗菌、抗炎和抗腫瘤的作用[10,11]。在骨肉瘤的研究中，白花丹素明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖和誘導細胞的凋亡，降低Bcl-2蛋白表達，增加Bax蛋白表達[12]，這與本研究結(jié)果相似。周群等[13]研究結(jié)果顯示，白花丹素通過調(diào)控JNK通路抑制舌鱗狀細胞癌細胞的增值和誘導細胞細胞凋亡。何遠橋[14]研究結(jié)果顯示，白花丹素能有限抑制膀胱癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并促進細胞的凋亡。以上均說明白花丹素具有一定的抗腫瘤作用，本研究顯示，白花丹素呈濃度依賴性有限抑制結(jié)直腸癌細胞的活力，促進細胞凋亡率，上調(diào)p21、Bax蛋白表達，下調(diào)Ki67、Bcl-2蛋白表達，說明白花丹素能抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和誘導細胞的凋亡，具有抗癌的作用。

ZEB1是ZEB家族成員之一，在多種腫瘤內(nèi)過度表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分類等有關(guān)[15,16]，如ZEB1在前列腺癌細胞內(nèi)高表達，抑制ZEB1通過下調(diào)ERK1/2信號通路抑制前列腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并促進細胞的凋亡[17]。有研究結(jié)果顯示，ZEB1在結(jié)直腸癌組織內(nèi)高表達，與癌癥分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切先關(guān)[18]，提示ZEB1與結(jié)直腸癌具有重要作用。Li等[19]研究結(jié)果顯示，沉默ZEB1能抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。丁夢[20]研究結(jié)果顯示，ZEB1是miRNA-141靶基因，miRNA-141通過調(diào)控ZEB1抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并促進細胞的凋亡，以上均說明ZEB1可以作為結(jié)直腸癌的潛在生物標記物。白花丹素處理SW480細胞，ZEB1 mRNA和蛋白表達下調(diào)，提示白花丹素能夠抑制ZEB1的表達。利用沉默干擾技術(shù)，沉默ZEB1能降低結(jié)直腸癌細胞的活力，增加細胞的凋亡率，p21、Bax蛋白表達上調(diào)，Ki67、Bcl-2蛋白表達下調(diào)，說明抑制ZEB1的表達在結(jié)直腸癌內(nèi)有抗腫瘤的作用。進一步研究白花丹素對結(jié)直腸癌的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達ZEB1能夠逆轉(zhuǎn)白花丹素對結(jié)直腸癌細胞的增殖和凋亡的作用，說明白花丹素能夠通過調(diào)控ZEB1的表達發(fā)揮在結(jié)直腸癌內(nèi)的作用。

綜上所述，白花丹素通過調(diào)控ZEB1的表達能有效抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和促進細胞的凋亡，為白花丹素抗癌的研究提供了數(shù)據(jù)支撐。