李蓉 姚國敏 周凌霄 閆瑾 張敏 李亞

在對先天性靜脈畸形骨肥大綜合征患者的研究中，發(fā)現(xiàn)了具有多個特殊結(jié)構(gòu)域的新基因，即G補綴FHA域血管生成因子1(angiogenic factor with G patch and FHA domains 1，AGGF1)。該基因廣泛表達于人體組織和器官，如腦、眼、心臟等[1]。血管生成是指血管內(nèi)皮細胞在已形成的毛細血管的基礎(chǔ)上原位增殖和遷移，以形成新毛細血管的過程[2]。血管生成涉及多種因素和復(fù)雜信號[3]，其中，近年來AGGF1已被證實參與血管發(fā)育，具有強烈的促血管生成作用[4]。在血管性疾病領(lǐng)域，AGGF1具有治療冠心病及心肌梗死[5]、糖尿病血管并發(fā)癥的潛能[6]。而在腫瘤領(lǐng)域，AGGF1被證實是抗腫瘤血管新生、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要靶點[7,8]。研究證實，AGGF1促進了高糖、高氧下的視網(wǎng)膜新生血管形成，可能參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜疾病的病理機制[9,10]。自噬是一種作為對應(yīng)激的應(yīng)答、被嚴格調(diào)控的溶酶體降解機制，從而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在生理狀態(tài)和疾病中均發(fā)揮重要作用[11]。我們的前期研究表明，應(yīng)激狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞自噬的激活參與了視網(wǎng)膜血管生成過程[12,13]。鑒于此，我們推測，激活細胞自噬可能是AGGF1發(fā)揮促視網(wǎng)膜血管生成的一種重要機制。本研究擬以視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞為對象，觀察AGGF1作用下對細胞遷移和管腔結(jié)構(gòu)形成的影響，進而通過阻斷自噬激活的關(guān)鍵信號通路，觀察AGGF1對視網(wǎng)膜血管生成的作用是否受到抑制，從而明確AGGF1發(fā)揮促視網(wǎng)膜新生血管生成作用的自噬機制，為進一步研究AGGF1在眼部疾病中的治療潛能和作用靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(HRMECs，上海中喬新舟生物科技有限公司)；M199培養(yǎng)基、胎牛血清及0.25%胰酶(美國Gibco公司)；人AGGF1重組蛋白(美國Abnova公司)；AMPK 抑制劑Compound C(美國Selleck公司)；Transwell小室及Matrigel(美國BD公司)；細胞RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人一抗AMPK、p-AMPK，mTOR，p-mTOR，ULK1，p-ULK1(美國Cell signaling公司)；兔多抗GAPDH (杭州賢至生物有限公司)；HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；GFP-LC3B質(zhì)粒(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)；Lip2000轉(zhuǎn)染試劑及Opti-MEM培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO，MCO-15AC型)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus，IX51型)；激光共聚焦顯微鏡(日本尼康，C2型)；低速離心機(美國Eppendorf，5702R型)；全自動酶標儀(美國Thermo scientific，Multiskan MK3型)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組：將液氮中凍存的HRMECs取出，快速放入37℃水浴鍋中解凍，然后轉(zhuǎn)移至含有5 ml M199培養(yǎng)基的離心管中，室溫離心收集細胞(1 200 r/min，3 min)；棄去上清后用含10%胎牛血清+1%青霉素、鏈霉素的M199培養(yǎng)基懸浮細胞，接種至培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，在37℃、飽和濕度條件的5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集細胞；PBS洗滌細胞2次后離心(1 200 r/min，3 min)；加入完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按1∶3的比例傳代，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下擴大培養(yǎng)。根據(jù)不同處理將細胞分為以下3組：對照組(常規(guī)培養(yǎng))，AGGF1組(在M199培養(yǎng)基中加入0.5 μg/ml AGGF1)，Compound C+AGGF1(在M199培養(yǎng)基中加入5 μmol/L的Compound C及0.5 μg/ml AGGF1)，3組細胞在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2 細胞遷移：采用Transwell小室法檢測細胞遷移能力。取生長狀態(tài)良好的細胞，制備單細胞懸液，計數(shù)后按照每孔5×105個接種至6孔板，在37℃、飽和濕度條件的5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜。根據(jù)上述不同分組處理細胞48 h，0.25%胰酶消化，收集細胞后離心(1 200 r/min×3 min)，棄去上清，PBS清洗2次后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至2×105/ml備用。在24孔板中加入800 μl M199培養(yǎng)基(含10%胎牛血清+1%青霉素、鏈霉素)，并放入Transwell小室，在上室分別接入200 μl各組細胞懸液，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。PBS清洗小室，70%冰乙醇溶液固定細胞1 h，0.5%結(jié)晶紫染液對細胞進行染色，室溫中放置20 min。PBS清洗后用擦凈上室一側(cè)未遷移的細胞，在顯微鏡下觀察拍照。每個小室隨機選取3個200倍的視野，計數(shù)遷移的細胞，取平均值。

1.2.3 細胞管腔形成：采用Matrigel法檢測細胞管腔形成能力。4℃條件融化Matrigel膠過夜，并預(yù)冷24孔板和移液器槍頭。向24孔板加入融化的Matrigel膠，每孔200 μl。低速無菌離心除去氣泡，在37℃下孵育30 min。0.25%胰酶消化不同分組培養(yǎng)48 h的細胞，用無血清培養(yǎng)基制成單細胞懸液，計數(shù)后按照每孔2×105/個細胞接種至有預(yù)鋪膠的24孔板中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜。在顯微鏡下觀察拍照，隨機選取3個100倍視野，采用Image J圖像分析軟件計數(shù)細胞管腔形成數(shù)目，取平均值。

1.2.4 自噬熒光：采用GFP-LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，觀察細胞內(nèi)的自噬熒光。取生長狀態(tài)良好的細胞，計數(shù)后以每孔5×105個細胞接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將要轉(zhuǎn)染的細胞，換成無血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h。取10 μl/孔Lip2000，用200 μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，混合后室溫孵育5 min；取4 μg質(zhì)粒，用50 μl Opti-MEM的培養(yǎng)基稀釋混勻。將稀釋的Lip2000和質(zhì)粒輕輕混合，室溫靜置20 min，以形成質(zhì)粒-Lip2000的混合物。將質(zhì)粒-Lip2000的混合物加入到含有細胞及培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h后將培養(yǎng)基換成含血清的培養(yǎng)基，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。根據(jù)不同分組處理細胞48 h，在熒光顯微鏡下觀察拍照。隨機選取3個400倍的視野，采用Image J圖像分析軟件計算平均熒光強度。

1.2.5 Western blotting：采用Western blotting法檢測細胞AMPK、mTOR及ULK1的蛋白表達。根據(jù)不同分組處理細胞48 h，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將40 μg樣品蛋白在10% SDS-PAGE上電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5% 脫脂奶粉的封閉液TBST溶液浸泡PVDF膜，室溫搖床孵育2 h。磷酸化蛋白用1% 胎牛血清封閉。用稀釋的一抗浸泡PVDF膜，在4℃條件下孵育過夜，所用抗體稀釋濃度分別為：AMPK(1∶1 000)，p-AMPK(1∶1 000)，mTOR(1∶1 000)，p-mTOR(1∶1 000)，ULK1(1∶1 000)，p-ULK1(1∶1 000)，GADPH(1∶1 000)。TBST充分洗膜后，用稀釋的HRP標記的相應(yīng)二抗(1:50000)在室溫下?lián)u床孵育2 h。TBST充分洗膜，除去多余二抗，ECL顯色曝光，晾干后掃描膠片，用BandScan軟件分析膠片灰度值，與內(nèi)參照GAPDH的表達進行比較，計算各目的蛋白的相對表達量，每組進行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 HRMECs細胞遷移情況 3組細胞遷移比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，AGGF1組和Compound C+AGGF1組細胞遷移數(shù)均明顯增多(P<0.05)。與AGGF1組比較，Compound C+AGGF1組細胞遷移數(shù)降低(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 3組細胞遷移情況比較

圖1 顯微鏡下觀察各組細胞遷移情況(標尺=100 μm)

2.2 HRMECs細胞管腔形成情況 3組間細胞管腔形成數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，AGGF1組和Compound C+AGGF1組的細胞管腔形成數(shù)均明顯增多(P<0.05)；與AGGF1組比較，Compound C+AGGF1組的細胞管腔形成數(shù)降低(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 3組細胞管腔形成數(shù)比較

圖2 顯微鏡下觀察各組細胞管腔形成情況(標尺=100 μm)

2.3 HRMECs自噬情況 GFP-LC3B融合蛋白熒光檢測結(jié)果顯示三組間熒光強度的總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組細胞中出現(xiàn)較弱的GFP綠色熒光信號，AGGF1組綠色熒光明顯強于對照組和Compound C+AGGF1組(P<0.05)；Compound C+AGGF1組的綠色熒光強于對照組(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 3組細胞GFP-LC3B平均熒光強度比較

圖3 激光共聚焦顯微鏡下觀察各組轉(zhuǎn)染GFP-LC3B質(zhì)粒的HRMECs細胞自噬(GFP-綠色熒光；標尺=100 μm)

2.4 HRMECs中AMPK-mTOR-ULK1自噬信號通路關(guān)鍵蛋白表達情況 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，AGGF1組HRMECs細胞自噬被激活，表現(xiàn)為AMPK-mTOR-ULK1信號通路中關(guān)鍵蛋白p-AMPK和p-ULK1蛋白表達條帶的明顯增強和p-mTOR蛋白表達條帶的明顯減弱。當采用Compound C處理細胞時，p-AMPK和p-ULK1的蛋白表達則明顯減弱，而p-mTOR的蛋白表達則明顯增強。對照組、AGGF1組和Compound C+AGGF1組間細胞AMPK、mTOR和ULK1的相對表達量總體比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組、AGGF1組和Compound C+AGGF1組間細胞p-AMPK、p-mTOR和p-ULK1的相對表達量總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AGGF1組細胞中p-AMPK和p-ULK1值均明顯大于對照組和Compound C+AGGF1組(P<0.05)，AGGF1組細胞中p-mTOR值明顯小于對照組和Compound C+AGGF1組(P<0.05)。Compound C+AGGF1組細胞中p-AMPK和p-ULK1值均高于對照組(P<0.05)，其p-mTOR值低于對照組。見圖4，表4。

圖4 3組細胞AMPK-mTOR-ULK1自噬信號通路關(guān)鍵蛋白表達比較

表4 Western blotting檢測各組蛋白的相對表達量

3 討論

由于內(nèi)皮細胞功能障礙是視網(wǎng)膜新生血管性疾病的主要特征，因此本研究選擇HRMECs，一種常用的細胞模型進行觀察[14,15]。結(jié)果提示，AGGF1直接處理HRMECs可以明顯促進細胞遷移和管腔形成，與我們前期在其他視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞模型中觀察到的結(jié)果[9,10]一致，證明了AGGF1具有促進視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞血管生成的作用。目前關(guān)于AGGF1促血管生成的機制研究還較少，有研究提示雖然其效應(yīng)類似于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，但進一步研究發(fā)現(xiàn)其作用與VEGF信號通路無關(guān)[1,16]。在針對冠心病和心肌梗死治療策略的研究中發(fā)現(xiàn)，維持或增強自噬是增強AGGF1促血管生成的新機制，主要涉及JNK信號通路的激活[16]，但在視網(wǎng)膜血管生成中，AGGF1的作用及分子機制還不清楚。

研究證實，AMPK-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinm，TOR)-Unc-51樣激酶1 (Unc-51-like kinase 1，ULK1)信號通路對自噬具有重要的調(diào)控作用，對該通路的深入研究將有助于更好地理解細胞自噬過程，并為自噬相關(guān)疾病的治療提供新的靶點[17]。已證實多個與自噬相關(guān)的特異性基因(ATG)編碼相應(yīng)的蛋白，協(xié)同參與自噬體形成的各個階段。其中，微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3(LC3)是ATG8在哺乳動物的類似物，廣泛分布于哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞中[18]。LC3B參與自噬的全部過程[19,20]，通過免疫印跡或免疫熒光檢測LC3B已成為監(jiān)測自噬及自噬相關(guān)過程的可靠方法[18]。

本研究采用Compound C作為AMPK信號通路最常用的化學(xué)抑制劑[21]，利用免疫印跡和LC3B免疫熒光的方法觀察了阻斷AMPK-TOR-ULK1途徑時，AGGF1對HRMECs細胞血管形成的作用是否受到影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Compound C處理細胞時，可顯著降低細胞p-AMPK和 p-ULK的蛋白表達水平，增加p-mTOR的表達，最終降低LC3B的表達，與在其他細胞中的研究結(jié)果[22]相一致。這些結(jié)果均表明AMPK-mTOR-ULK1信號通路與自噬激活有關(guān)，而Compound C可有效抑制細胞自噬激活。本研究同時還發(fā)現(xiàn)Compound C可明顯減弱AGGF1作用下的細胞遷移和管腔形成，提示AMPK-mTOR-ULK1信號通路與AGGF1介導(dǎo)的自噬有關(guān)，且通過此通路上調(diào)自噬水平是AGGF1發(fā)揮促視網(wǎng)膜血管生成效應(yīng)的一種分子機制。

綜上所述，本研究證實了AGGF1通過激活A(yù)MPK-mTOR-ULK1信號通路而促進HRMECs的自噬激活，后者最終通過增強細胞遷移和管腔形成能力，發(fā)揮促進視網(wǎng)膜血管生成的作用。不過，體外細胞實驗結(jié)果與體內(nèi)生理、病理狀態(tài)存在一定差異，本研究結(jié)果還需要在體實驗進行驗證。另外，本研究只觀察了AGGF1對正常狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的作用，未對病理狀態(tài)下，如缺氧、高糖的作用和機制進行觀察，故不能說明AGGF1在眼部疾病中效應(yīng)及機制，尚需進一步利用相應(yīng)的疾病模型進行深入觀察。