宋玉霞 趙芳 趙濤 周莎莎 王雪娟 郭樺

卵巢癌在女性生殖道惡性腫瘤中致死率最高，由于沒(méi)有早期癥狀，>70%的患者在診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期[1]。雖然隨著徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)(R0)+鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案推廣，卵巢癌患者生存有所改善，但晚期患者5年生存率仍徘徊在32%～46%[2]。因此，進(jìn)一步探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中相關(guān)因子的變化對(duì)其早期診斷及預(yù)后具有重要意義?；チ黾?xì)胞源性生長(zhǎng)因子(PC cell-derived growth factor，PCDGF)是顆粒蛋白超家族成員之一，其表達(dá)升高可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及血管生成，研究證實(shí)PCDGF與肺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3,4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作為腫瘤微環(huán)境中重要細(xì)胞缺氧感受分子，介導(dǎo)了大部分的缺氧應(yīng)激反應(yīng)，在缺氧環(huán)境下能誘導(dǎo)多種蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[5]。本研究通過(guò)對(duì)照研究，觀察卵巢癌組織中PCDGF及HIF-1α的表達(dá)水平，探討二者表達(dá)的相關(guān)性及其與卵巢癌患者臨床、預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月至2015年9月在石家莊市人民醫(yī)院婦科手術(shù)切除的卵巢癌組織82例，選取因子宮脫垂行全子宮雙附件切除或BRCA基因檢測(cè)突變陽(yáng)性行預(yù)防性雙附件切除者的正常卵巢組織33例，年齡35～75歲，平均(50.0±12.3)歲;年齡 <50歲39例，年齡≥50歲43例；根據(jù)FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期49例，Ⅳ期9例；根據(jù)腫瘤的組織學(xué)分化程度區(qū)分：高分化12例，中分化50例，低分化20例；根據(jù)組織學(xué)分類(lèi)區(qū)分：漿液性56例，黏液性15例，子宮內(nèi)膜樣11例。正常卵巢組患者年齡39～70歲，平均(52.0±11.6)歲，2組患者的年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。患者臨床資料完善、病理診斷明確，且均排除其他系統(tǒng)腫瘤，術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。所有存檔蠟塊組織重新做常規(guī)HE染色且由2名高級(jí)職稱(chēng)病理醫(yī)生復(fù)查篩選后方可入組，本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆抗體Anti-HIF-1α抗體[EP1215Y](ab51608)、Anti-PCDGF抗體[EPR15864](ab208777)均購(gòu)自Abcam公司，DAB顯色劑、EDTA抗原修復(fù)液、二抗SP-9001試劑盒等均購(gòu)于北京中杉金橋。采用顯微鏡及多功能圖像分析工作站(OLYMPUS，CX21，日本)進(jìn)行閱片及圖像采集。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化：采用S-P免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)PCDGF蛋白及HIF-1α蛋白的表達(dá)情況，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。主要步驟：石蠟組織連續(xù)切片4 μm、二甲苯脫蠟后3%H2O2滅活，EDTA(pH值=8.0)抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)，10%山羊血清封閉，加一抗(PCDGF兔抗人多克隆抗體稀釋比例1∶100、HIF-1α兔抗人單克隆抗體稀釋比例1∶250)，4℃孵育過(guò)夜；PBS液適當(dāng)沖洗后滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、封片。

1.3.2 結(jié)果判讀：PCDGF蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，陽(yáng)性表現(xiàn)為黃色、棕黃色顆粒；HIF-1α蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。免疫組化染色結(jié)果半定量分析計(jì)數(shù)系統(tǒng)，根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度綜合計(jì)分進(jìn)行結(jié)果判斷。由2名高級(jí)職稱(chēng)病理醫(yī)生采用雙盲法并獨(dú)立對(duì)切片進(jìn)行染色評(píng)估，每張切片在高倍鏡下(200 ×)隨機(jī)觀察10個(gè)視野。細(xì)胞染色程度: 藍(lán)色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，依次評(píng)為0、1、2、3分; 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):將陽(yáng)性細(xì)胞比值的0～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、> 75%分別評(píng)為0、1、2、3、4分。將兩項(xiàng)得分相乘后的分值為每張切片的最終評(píng)分(0～12分): 0分為陰性(-)，1～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～8分為中等陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。最終將免疫組化結(jié)果劃分2組: 低表達(dá)組(-～+)和高表達(dá)組(++～+++)，其中以高表達(dá)組之和計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.4 隨訪 采用電話或門(mén)診隨訪。隨訪時(shí)間為術(shù)后3～80個(gè)月，中位隨訪時(shí)間46個(gè)月，隨訪終點(diǎn)事件為患者死亡或者到達(dá)隨訪截止時(shí)間(2020年10月)。

2 結(jié)果

2.1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá) PCDGF以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，在正常卵巢組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于卵巢癌組織(P< 0.001)；HIF1-α陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，在正常卵巢組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于卵巢癌組織(χ2=7.730，P=0.005)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌組織中的蛋白表達(dá)(SP×200)

表1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá) 例(%)

2.2 PCDGF和HIF1-α的表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 PCDGF的高表達(dá)與患者腫瘤FIGO分期呈正相關(guān)(P=0.029)，而與患者年齡、腫瘤類(lèi)型及腫瘤分化程度無(wú)相關(guān)性(P> 0.05)；HIF1-α的高表達(dá)與FIGO分期呈正相關(guān)(P=0.005)，在漿液性腫瘤組織中的表達(dá)高于其他類(lèi)型腫瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，而與患者年齡、腫瘤分化程度無(wú)關(guān),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PCDGF和HIF1-α的表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 卵巢癌中PCDGF與HIF1-α表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果表明，卵巢癌中PCDGF和HIF1-α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.317，P=0.004)。見(jiàn)表3。

表3 PCDGF與HIF1-α表達(dá)的相關(guān)性 例

2.4 PCDGF與HIF1-α的表達(dá)水平與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系 隨訪5年，82例患者整體生存率為28.1%(23/82)。PCDGF高表達(dá)組5年生存率為23.4%(15/645)，低表達(dá)組5年生存率為38.9%(7/18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HIF-1α高表達(dá)組5年生存率為17.0%(8/47)，低表達(dá)組5年生存率為48.2%(17/35)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 PCDGF與HIF1-α的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系(Kaplan-Meier法)

3 討論

本研究從缺氧這一腫瘤特有的微環(huán)境出發(fā)[6-8]，通過(guò)檢測(cè)上皮性卵巢腫瘤組織中PCDGF、HIF-1α的表達(dá)，探討PCDGF、HIF-1α與卵巢癌病理特征及臨床預(yù)后之間的關(guān)系；

PCDGF作為一種自分泌生長(zhǎng)因子與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲及細(xì)胞存活密切相關(guān)。黃權(quán)生等[9]研究結(jié)果顯示PCDGF在肺癌患者中高表達(dá)。宋鵬等[4]研究表明在鼻咽癌組織中PCDGF呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者差的預(yù)后相關(guān)。馬明忠等[10]在喉鱗癌Hep-2細(xì)胞中抑制PCDGF的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到抑制，細(xì)胞凋亡明顯增加，以上結(jié)果提示PCDGF在多種腫瘤惡性演進(jìn)中扮演著重要角色。本研究結(jié)果表明在卵巢癌組織中PCDGF陽(yáng)性表達(dá)率為78.8%，明顯高于正常卵巢組織，且高表達(dá)組患者5年生存率明顯低于低表達(dá)組，與宋鵬等[4]研究結(jié)果類(lèi)似。進(jìn)一步分析表明PCDGF高表達(dá)與腫瘤分期呈正相關(guān)，據(jù)此我們推測(cè)卵巢癌組織中PCDGF高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移導(dǎo)致腫瘤臨床分期進(jìn)展，并最終影響卵巢癌患者預(yù)后。

HIF介導(dǎo)了大部分的缺氧應(yīng)激反應(yīng)，根據(jù)α亞基的不同，HIF-α可以分為HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中HIF-1α是調(diào)控缺氧應(yīng)激的主要成員[11，12]。Magliulo等[13]發(fā)現(xiàn)阻斷HIF-α表達(dá)可以抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。HIF-1不僅能降低腫瘤細(xì)胞代謝的氧耗量，調(diào)節(jié)糖酵解作用酶，使其能在缺氧條件下以不耗氧的方式合成三磷酸腺苷，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且可參與上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞外基質(zhì)的形成及促進(jìn)與癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞的聚集，為腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲創(chuàng)造條件，同時(shí)可影響腫瘤的免疫調(diào)節(jié)。另外，HIF-1α還可以上調(diào)P-gp及多藥耐藥(MDR)基因及耐藥蛋白的表達(dá)，引起腫瘤耐藥[14]。已發(fā)現(xiàn)HIF-1α在很多腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、腎癌及結(jié)腸癌。近年來(lái)有關(guān)HIF-1α在卵巢癌中的表達(dá)及意義研究也成為熱點(diǎn)[15]，本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在卵巢癌組織中高表達(dá)主要見(jiàn)于漿液性腫瘤及分期較晚者，提示HIF-1α蛋白的表達(dá)與卵巢上皮性癌的潛在惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，進(jìn)一步預(yù)后分析表明HIF-1α高表達(dá)組患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)組。施宣忍等[16]研究表明HIF-1α通過(guò)調(diào)控MMP13表達(dá)增強(qiáng)缺氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。韓煜雯等[17]研究表明，HIF-1α可與BMP4協(xié)同作用，參與缺氧微環(huán)境的調(diào)控，促進(jìn)上皮性卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移。這與本研究結(jié)果一致。因此，推測(cè)HIF-1α可以作為卵巢癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，并且可以預(yù)測(cè)卵巢癌患者的預(yù)后。

同時(shí)，本研究表明卵巢癌組織中PCDGF和HIF1-α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，這與前期宋鵬等[4]在鼻咽癌中的研究是一致的，提示二者間存在密切關(guān)系，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，卵巢癌組織中PCDGF和HIF1-α表達(dá)升高，且其表達(dá)水平與患者臨床、預(yù)后關(guān)系密切，表達(dá)升高提示患者預(yù)后不佳。