殷啟潤，李冰，熊永潔，賀紹君

(安徽科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

熱應(yīng)激(heat stress，HS)是高溫條件下畜禽通過克服不利于自身生長發(fā)育的生理狀態(tài)而產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)，當(dāng)前畜牧業(yè)的集約化發(fā)展現(xiàn)狀，畜禽在生長發(fā)育階段不斷面臨多種應(yīng)激的挑戰(zhàn)，熱應(yīng)激是不可忽略的應(yīng)激原之一[1-2]。夏季高溫高濕環(huán)境使動物生產(chǎn)性能降低，免疫機(jī)能下降[3]，誘發(fā)動物疾病直至死亡，對畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成重要經(jīng)濟(jì)損失。恒溫動物普遍存在等熱區(qū)[4]，畜禽可以通過外界環(huán)境調(diào)節(jié)及能量的消耗達(dá)到機(jī)體的平衡狀態(tài)，維持正常體溫與代謝，一旦環(huán)境溫度過高，動物機(jī)體無法恢復(fù)體內(nèi)平衡，內(nèi)分泌紊亂，機(jī)能代謝與生產(chǎn)性能受到威脅，則會產(chǎn)生熱應(yīng)激[5]。腸道作為動物體內(nèi)最重要的微生物屏障體系，存在大量的腸道菌群微生物，動物對水、離子及有機(jī)分子的吸收與運(yùn)輸都受到腸道上皮屏障的控制，腸上皮細(xì)胞的頂端質(zhì)膜與細(xì)胞間緊密連接是維持腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式[6]。緊密連接是多蛋白復(fù)合物，具有固定上皮細(xì)胞維持細(xì)胞間極性及通透性屏障的作用，其中Occludin負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白正常功能的運(yùn)行，主要分布位置在細(xì)胞膜上；Claudins是構(gòu)成緊密連接復(fù)合體的主鏈，能夠影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖、分化、受體功能和遷移的屏障功能[7]。Claudins通過其屏障和通道功能阻止腔內(nèi)抗原的入侵，調(diào)節(jié)細(xì)胞連接滲透性；Zo-1具有維持上皮細(xì)胞極性的作用。腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定可以保證機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，腸道菌群結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致腸道黏膜損傷[8]。馮躍進(jìn)[9]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激對機(jī)體十二指腸、盲腸、回腸以及空腸都造成不同程度的損傷，其中對十二指腸的損傷尤為顯著。熱應(yīng)激降低腸道胰蛋白酶及淀粉酶活性、微生物菌群發(fā)生紊亂，增加沙門氏菌數(shù)量[10]。李潔蕾等[11]研究發(fā)現(xiàn)，43 ℃熱應(yīng)激條件下大鼠直腸溫度顯著高于對照組，熱應(yīng)激導(dǎo)致大鼠平均日增重降低。劉曉曦等[12]研究表明，熱應(yīng)激條件下大鼠回腸構(gòu)成免疫球蛋白A的能力下降、細(xì)胞因子免疫功能減弱，使大鼠腸系膜淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)受到損傷，降低樹突狀細(xì)胞呈遞抗原的能力，導(dǎo)致腸道細(xì)胞免疫功能低下。

本試驗以大鼠小腸隱窩上皮(IEC-6)細(xì)胞為研究對象，其來源于大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞，在體外能夠長期傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定增殖，具有腸隱窩上皮細(xì)胞特質(zhì)，通過體外培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞，運(yùn)用CCK-8方法篩選熱應(yīng)激溫度、流式細(xì)胞術(shù)檢測熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞凋亡率及周期的影響以及Western blot檢測相關(guān)凋亡及緊密連接蛋白的表達(dá)，從分子水平上探究熱應(yīng)激對腸道細(xì)胞的損傷機(jī)制，為生產(chǎn)中防治熱應(yīng)激對動物造成損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

IEC-6細(xì)胞系購自中國北京協(xié)和資源中心；Cell Counting Kit-8(1016Z013)，購自Solarbio，中國；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(20200629)，購自Solarbio，中國；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(082219200521)，購自Beyotime，中國；鼠抗β-actin(10004156)，購自Proteintech，美國，1∶2 000；兔抗Bcl-2(00084007)，購自Proteintech，美國，1∶500；兔抗Bax(00082363)，購自Proteintech，美國，1∶1 000；兔抗Cleaved Caspase-3(00085676)，購自Proteintech，美國，1∶1 000；兔抗Occludin(ab167161)，購自Abcam，英國，1∶500；兔抗Claudin(ab180158)，購自Abcam，英國，1∶500。

1.2 IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)與分組

于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞，當(dāng)IEC-6細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時消化處理，隨后加入1 mL含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)液終止消化，分皿并進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。

試驗分為對照組與熱應(yīng)激組，每組至少3個重復(fù)。熱應(yīng)激組的溫度設(shè)置為37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3 細(xì)胞活性檢測

制備IEC-6細(xì)胞懸液并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至6×104個/mL，向96孔板每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，將96孔板轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別于37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱應(yīng)激處理24 h。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時，每孔加入10 μL CCK-8溶液后孵育2 h，使用酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔吸光度并計算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。

1.4 熱應(yīng)激對細(xì)胞凋亡率的影響

對IEC-6細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，根據(jù)CCK-8試驗結(jié)果篩選出試驗溫度，分別設(shè)置對照組(37 ℃)與熱應(yīng)激組(41 ℃)，每組3個重復(fù)。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到70%時，將對照組與熱應(yīng)激組分別轉(zhuǎn)移至對應(yīng)培養(yǎng)箱中24 h。按照Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit說明書處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果通過FLOWJO V10軟件分析。

1.5 熱應(yīng)激對細(xì)胞周期的影響

對IEC-6細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，根據(jù)CCK-8試驗結(jié)果篩選出試驗溫度，分別設(shè)置對照組(37 ℃)與熱應(yīng)激組(41 ℃)，每組3個重復(fù)。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到70%時，將對照組與熱應(yīng)激組分別轉(zhuǎn)移至對應(yīng)培養(yǎng)箱24 h。按照Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit說明書處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果通過FLOWJO V10軟件分析。增殖指數(shù)(PI)=DNA合成期(S)+DNA合成后期(G2)/細(xì)胞分裂期(M)。

1.6 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞凋亡蛋白及緊密連接蛋白表達(dá)的影響

1.6.1 細(xì)胞全蛋白的提取及測定

向?qū)φ战M與熱應(yīng)激組細(xì)胞沉淀中加入配制好的細(xì)胞裂解液，渦旋震蕩后冰上裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，上清液即為全蛋白提取物。

根據(jù)BCA說明書要求測定每組細(xì)胞內(nèi)蛋白含量，將上樣蛋白濃度統(tǒng)一調(diào)整為50 μg/μL，加入上樣緩沖液后，放入95 ℃水浴鍋中進(jìn)行煮沸15 min，蛋白充分變性后進(jìn)行冷卻，-80 ℃條件下將蛋白樣品進(jìn)行分裝保存。

1.6.2 Western blot檢測凋亡及緊密連接蛋白表達(dá)水平

配制12%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，恒壓90 V條件下電泳30～40 min，調(diào)整電壓至120 V，直至條帶跑出凝膠，時間約為1 h；半干轉(zhuǎn)膜法，調(diào)整電流為150 mA，轉(zhuǎn)膜1 h；PVDF膜置于5%脫脂奶粉進(jìn)行孵育，室溫，1.5 h；將封閉后的PVDF膜放入對應(yīng)的一抗中，4 ℃，過夜；使用1×TBST洗膜4次，每次10 min；將PVDF膜放入對應(yīng)的二抗中進(jìn)行孵育，室溫，2 h；使用1×TBST洗滌PDVF膜4次，每次10 min；按比例添加顯影液后上機(jī)進(jìn)行曝光操作。內(nèi)參蛋白為β-action。

曝光后條帶后用ImageJ分析條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)量依據(jù)如下公式計算：

Ratio比值=IOD目的蛋白/IOD內(nèi)參。

1.7 數(shù)據(jù)處理

每種試驗至少進(jìn)行3次重復(fù)，利用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計分析，GraphPad Prism軟件進(jìn)行圖片制作，多組數(shù)據(jù)間差異性使用Duncan進(jìn)行比較，兩組數(shù)據(jù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激對細(xì)胞活性的影響

由圖1可知，隨著溫度的提高，IEC-6細(xì)胞活性逐漸降低，與對照組相比，41 ℃、42 ℃可以顯著降低細(xì)胞活性(P<0.05)。

2.2 熱應(yīng)激對細(xì)胞凋亡及周期的影響

運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測IEC-6細(xì)胞凋亡率，結(jié)果由圖2可知，與對照組相比，熱應(yīng)激組細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)。

圖2 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞凋亡率的影響

每管樣品收集20 000個細(xì)胞，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對IEC-6細(xì)胞周期進(jìn)行檢測。與對照組相比，熱應(yīng)激組DNA合成前期(G0/G1)期峰值極顯著升高(P<0.01)(圖3)；熱應(yīng)激組S期(圖4)以及G2/M期峰值極顯著低于對照組(P<0.01)(圖5)，熱應(yīng)激與細(xì)胞增殖指數(shù)呈正相關(guān)，熱應(yīng)激時細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低(P<0.05)(圖6)。

圖3 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞G0/G1期的影響

圖4 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞S期的影響

圖5 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞G2/M期的影響

圖6 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

2.3 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

運(yùn)用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與對照相比，熱應(yīng)激組Bax蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；熱應(yīng)激組Caspase-3蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax一般為固定值，在外界條件刺激下Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)量會有所改變，結(jié)果如圖8所示，與對照組相比，熱應(yīng)激組內(nèi)Bcl-2/Bax的值極顯著降低(P<0.01)。

圖7 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

圖8 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞中Bcl-2/Bax的影響

2.4 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白的影響

運(yùn)用Western blot法檢測緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖9所示，與對照組相比，熱應(yīng)激組Occludin、Claudin-1蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。

圖9 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

3 討論

3.1 熱應(yīng)激對細(xì)胞活性的影響

較高的環(huán)境溫度能夠誘導(dǎo)動物機(jī)體發(fā)生一系列生理變化，了解熱應(yīng)激引起動物損傷的機(jī)制，有助于采取有效的措施減少熱應(yīng)激帶來的不良反應(yīng)。熱應(yīng)激能夠引發(fā)動物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，ROS的產(chǎn)生和有效抗氧化防御之間的不平衡誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[13]。宋學(xué)立等[14]研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是對細(xì)胞造成損傷的主要原因之一。本試驗中，與對照組相比，熱應(yīng)激時IEC-6活細(xì)胞數(shù)量隨溫度升高而減少，說明熱應(yīng)激可能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生，導(dǎo)致了細(xì)胞活性的喪失。

3.2 熱應(yīng)激對細(xì)胞凋亡及周期的影響

本試驗中，與對照組相比，熱應(yīng)激組細(xì)胞凋亡率極顯著上升。凋亡是一種進(jìn)化保存形式的程序化細(xì)胞死亡，在維持多細(xì)胞生物體正常組織和細(xì)胞生理學(xué)中起著重要作用，與細(xì)胞壞死是兩種不同的細(xì)胞死亡途徑，凋亡不會引起炎癥反應(yīng)[15]。細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的被動形式，而凋亡是一種高度調(diào)控的細(xì)胞自毀形式，包括細(xì)胞的有序脫離、細(xì)胞質(zhì)的凝聚、核的降解、細(xì)胞成分結(jié)構(gòu)和功能的破碎以及細(xì)胞的收縮[16]，最后，細(xì)胞轉(zhuǎn)化為“凋亡體”。熱應(yīng)激顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，通過對細(xì)胞周期分析，熱應(yīng)激時IEC-6細(xì)胞G0/G1期受到阻滯，抑制IEC-6細(xì)胞中DNA的復(fù)制與合成，延緩細(xì)胞增殖過程，抑制細(xì)胞的分裂與合成。

3.3 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

本試驗IEC-6細(xì)胞中Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著上升，說明細(xì)胞凋亡通路被誘導(dǎo)激活，正常的細(xì)胞凋亡有助于維持細(xì)胞數(shù)量和正常細(xì)胞更替[17]，但異常的細(xì)胞凋亡往往對機(jī)體正常的生理功能造成損傷。細(xì)胞凋亡受到內(nèi)源性或外源性途徑的調(diào)控，凋亡調(diào)控因子包括Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9等，在外源性通路中，在外部信號通路刺激下引發(fā)凋亡，包括死亡受體、補(bǔ)體配體、死亡區(qū)域和Caspase-3，一些重要的補(bǔ)體配體的例子包括FasL/FasR、tnf-a/tnfr1、Apo3L/DR3、Apo2L/DR4和Apo2L/DR5也參與了調(diào)節(jié)過程，當(dāng)配體與死亡受體結(jié)合時觸發(fā)了凋亡信號，進(jìn)而激活死亡域，將procaspase-3激活為Caspase-3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。熱應(yīng)激顯著下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，原因是熱應(yīng)激時內(nèi)源性凋亡發(fā)生，Bax蛋白由于刺激向線粒體外膜移動，在線粒體膜上形成一個開口，使細(xì)胞色素C從線粒體膜間遷移到細(xì)胞質(zhì)中[19]，與線粒體膜上另一凋亡蛋白Bak蛋白相互作用誘導(dǎo)線粒體片段化，從而與Bcl-2蛋白發(fā)生拮抗作用，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)。細(xì)胞凋亡受到Bcl-2與Bax蛋白比例的調(diào)控，本試驗熱應(yīng)激時Bcl-2與Bax比值顯著降低，說明熱應(yīng)激誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡機(jī)制。

3.4 熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

緊密連接由多種跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白組成，包括Occludins、Claudins以及ZO-1，它們與細(xì)胞肌動蛋白骨架相互作用對維持上皮屏障的完整性至關(guān)重要。屏障完整性的喪失往往會導(dǎo)致炎癥性腸病、肥胖和代謝性疾病[20]。本試驗結(jié)果表明，熱應(yīng)激可以顯著下調(diào)Occludin與Claudin-1蛋白的表達(dá)，降低腸道細(xì)胞的完整性，同時會擴(kuò)大細(xì)胞間通透性，能夠改變緊密連接結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)狀已被證明對機(jī)體有害，熱應(yīng)激的產(chǎn)生抑制腸上皮細(xì)胞間緊密連接作用，削弱腸道的機(jī)械屏障，調(diào)控腸道黏膜通透性的開放，Claudin-1蛋白表達(dá)量下調(diào)降低腸道的黏膜免疫力，減弱腸道的屏障功能。

4 結(jié)論

綜上，與37 ℃培養(yǎng)溫度相比，41 ℃時IEC-6細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著上升；高溫導(dǎo)致細(xì)胞G0/G1期阻滯，抑制DNA復(fù)制及合成，延緩細(xì)胞增殖過程；熱應(yīng)激上調(diào)凋亡蛋白表達(dá)，降低Bcl-2與Bax比值，下調(diào)Occludin與Claudin-1蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞間緊密連接作用。

與37 ℃對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同圖1 熱應(yīng)激對細(xì)胞活性的影響