張韜，付鈺廣，李寶玉，王金泉，劉光亮1，*

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是機(jī)體免疫反應(yīng)中主要的抗原遞呈細(xì)胞，其在啟動(dòng)、調(diào)節(jié)及維持免疫過程中有起著重要的作用[1-2]。DCs是一類特殊的抗原遞呈細(xì)胞群體，它們?cè)隗w內(nèi)不同位置及不同時(shí)間向免疫中樞遞呈抗原的方式也有所不同，不僅可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞以及B細(xì)胞，也可以依賴抗原啟動(dòng)二次免疫反應(yīng)[2-3]。DCs除了可以啟動(dòng)抗原特異性免疫，還可以調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)[4-5]。DCs表面的分子對(duì)其功能劃分提供了重要依據(jù)，如CD103+DCs在免疫反應(yīng)過程中主要調(diào)節(jié)自身與外源抗原的交叉呈遞、誘導(dǎo)腸道中效應(yīng)T細(xì)胞歸巢以及誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，而CD103-DCs在先天免疫過程中主要扮演抗原清除以及介導(dǎo)白細(xì)胞吸附的角色[6-7]。在機(jī)體內(nèi)只有少量的DCs可以直接與外界接觸并捕獲抗原，多數(shù)DCs主要存在上皮細(xì)胞下層，在血液中也存在未成熟的DCs[8-9]。當(dāng)遇到抗原時(shí)DCs被活化，相關(guān)DCs細(xì)胞會(huì)遷移到淋巴組織中激活B細(xì)胞以及T細(xì)胞，從而達(dá)到調(diào)控免疫反應(yīng)的作用[10-11]。

CD103+DCs是機(jī)體黏膜組織系統(tǒng)中的一類DCs亞群，其功能主要是可捕獲入侵黏膜系統(tǒng)的病原體并遷移至機(jī)體黏膜免疫系統(tǒng)的相關(guān)淋巴組織，通過分泌的細(xì)胞因子和抗原共同激活T細(xì)胞，活化的T細(xì)胞經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)B淋巴細(xì)胞的應(yīng)答，最終產(chǎn)生抗原特異性的分泌型IgA抗體，對(duì)黏膜系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和抵抗病原的入侵發(fā)揮著重要的作用[12-13]。CD103+DCs還可以誘導(dǎo)初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，參與黏膜組織的炎癥反應(yīng)及穩(wěn)態(tài)機(jī)制建立[14]。目前黏膜免疫應(yīng)答研究主要集中在人和小鼠，由于種屬及組織結(jié)構(gòu)分布等差異使得已有的黏膜應(yīng)答知識(shí)在豬機(jī)體不一定適用[15-16]。所以制備豬源DCs表面分子CD103的抗體對(duì)近一步研究豬機(jī)體的黏膜免疫反應(yīng)具重要意義。

鑒于CD103+DCs在黏膜免疫應(yīng)答中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，本研究為了深入研究豬機(jī)體的黏膜免疫應(yīng)答，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)制備了抗豬CD103+DCs表面分子CD103蛋白的多克隆抗體，并對(duì)其功能進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

原核表達(dá)載體pET-30a(+)、真核表達(dá)載體pcDNA3.1購(gòu)自Thermo Fisher，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21(DE3)購(gòu)自全式金生物有限公司，DNA Marker、protein Marker以及限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ和T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Fisher公司，質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，IPTG購(gòu)自SIGMA公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 重組CD103蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用TRIzol法提取豬呼吸道淋巴結(jié)(MLN)組織的RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為PCR擴(kuò)增模板，據(jù)NCBI基因庫(kù)公布的豬CD103基因序列(XM_021067683.1)設(shè)計(jì)特異性引物，因CD103分子蛋白分子量較大，導(dǎo)致后期在原核表達(dá)過程中表達(dá)困難，本研究分2段擴(kuò)增了CD103分子基因，分別為CD103分子基因的1～1 494 bp和1 435～2 931 bp。其引物分別為CD1031-1 494-F：5′-CGGAATTCATGGGTGCTCCC TACGTGCTC-3′；(酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ)；CD1031-1 494-R：5′-CCCTCGAGTTACGGAGCTGC CACCAGCAAGAG-3′(酶切位點(diǎn)為XhoⅠ)；CD1031 435-2 931-F：5′-CGGAATTCATGGA CCTCTTGCTGGTGGCAGCT-3′(酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ)；CD1031 435-2 931-R：5′-CCCTCGAGTTAGAGCTGGAAACCTTGCAATTTAACC-3′(酶切位點(diǎn)為XhoⅠ)。用上述引物以及cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD1031-1 494和CD1031 435-2 931目的基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ對(duì)目的基因以及pET-30a(+)空載體進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接目的基因以及pET-30a(+)載體，將連接成功的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30a-CD1031-1 494和pET-30a-CD1031 435-2 931分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將PCR、酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CD103蛋白的原核表達(dá)

將上述經(jīng)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET-30a-CD1031-1 494和pET-30a-CD1031 435-2 931分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，將感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)于具有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床220 r/min培養(yǎng)10～12 h后，待菌液的吸光度OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在誘導(dǎo)表達(dá)10～12 h后，經(jīng)離心收集菌體，將菌體經(jīng)超聲破碎釋放出蛋白，取超聲上清液及沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE，鑒定蛋白表達(dá)以及蛋白表達(dá)形式。

1.4 重組CD103蛋白純化

將適量可結(jié)合HIS標(biāo)簽的樹脂倒入親和層析柱中，用5倍體積柱緩沖液(20 mmol/L Tris-HC1，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl)平衡樹脂后，將適量上述已表達(dá)的蛋白樣品加入純化柱，于4 ℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合2 h后，使純化柱內(nèi)的液體自然流出并收集。用12倍于柱體積的緩沖液洗滌樹脂柱后，加入適量洗脫液，顛倒混勻后使洗脫液緩慢流出并收集，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)其洗脫效率，將含有目的蛋白的洗脫液匯集，測(cè)定其蛋白濃度并分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 CD103蛋白多克隆抗血清的制備

將純化后的CD1031-1 494和CD1031 435-2 931蛋白與弗氏佐劑混合后，于背部皮下多點(diǎn)免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，免疫劑量為每只小鼠200 μg，共進(jìn)行3次免疫，免疫間隔周期為14 d，在第3次加強(qiáng)免疫后一周，通過眼球毛細(xì)管采血收集小鼠多克隆抗血清。將純化后的CD1031-1 494和CD1031 435-2 931蛋白包被于ELISA板，依次孵育稀釋度為1∶5 000的鼠血清和羊抗鼠IgG，以間接ELISA的方法分析每次免疫后小鼠血清抗體滴度的變化趨勢(shì)、最終制備的多克隆血清的反應(yīng)性及抗體效價(jià)。

1.6 CD103蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建

為驗(yàn)證上述所制備多克隆血清的反應(yīng)性，將CD1031-2 931基因通過PCR、酶切及連接將目的基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，其克隆引物如下，CD1031-2 931-F：5′-CGGAATTCATGGGTGCTCCCTACGTGCTC-3′(酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ)；CD1031-2 931-R：5′-CGGATCCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGAGCTGGAAACCTTGCAATT-3′(酶切位點(diǎn)為BamHⅠ，添加標(biāo)簽蛋白His)，將目的基因與真核表達(dá)載體構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取單克隆菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后提取真核表達(dá)重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-CD1031-2 931并留存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 CD1031-2 931蛋白的真核表達(dá)及鑒定

復(fù)蘇HEK-293T細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞數(shù)目達(dá)到試驗(yàn)要求后將細(xì)胞鋪于6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑PEI分別將空載體質(zhì)粒pcDNA3.1和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CD1031-2 931轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并用NP-40裂解液裂解細(xì)胞收集細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。將所收集表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印于PVDF膜，加入5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h。之后，以抗His標(biāo)簽抗體(1∶5 000)作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)抗體作為二抗，用Western blot的方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

1.8 CD103蛋白多克隆抗體的功能驗(yàn)證

對(duì)CD103多克隆抗體的功能性驗(yàn)證包括Western blot驗(yàn)證和間接免疫熒光驗(yàn)證(indirect immunofluorescence assay, IFA)。

Western blot驗(yàn)證：將空載體質(zhì)粒pcDNA3.1和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CD1031-2 931轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞(轉(zhuǎn)染步驟按試劑說明書進(jìn)行操作)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物并經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印于PVDF膜，加入5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h后，以His標(biāo)簽抗體(1∶5 000)或CD103多克隆血清(1∶5 000)作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)抗體作為二抗，經(jīng)Western blot的方法檢測(cè)多克隆抗體的反應(yīng)性。

IFA驗(yàn)證：將空載體質(zhì)粒pcDNA3.1和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CD1031～2931轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，48 h后棄去細(xì)胞上清液并用PBS清洗細(xì)胞3次，用4%多聚甲醛于室溫固定細(xì)胞30 min，洗滌細(xì)胞后用0.5% TritonX-100對(duì)細(xì)胞透膜30 min，分別以His標(biāo)簽抗體(1∶5 000)或CD103多克隆抗體(1∶5 000)作為一抗室溫孵育1 h，PBST洗滌3次后，避光加入Alexa Flour488羊抗鼠IgG抗體(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，洗滌后加入DAPI于室溫孵育5 min，洗滌后于熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 CD103蛋白的基因擴(kuò)增和原核表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

用CD1031-1 494和CD1031 435-2 931特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到CD1031-1 494和CD1031 435-2 931基因片段，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠核酸電泳鑒定。結(jié)果顯示，成功獲得CD1031-1 494和CD1031 435-2 931基因片段，且分子量大小符合預(yù)期，結(jié)果如圖1所示。

M.DNA Marker；1. pET-30a(+)空載體；2. pET-30a空載體酶切(EcoRⅠ、XhoⅠ)；3. CD1031-2 931；4. pET-30a-CD1031-2 931；5. pET-30a-CD1031-2 931PCR鑒定；6. pET-30a-CD1031-2 931酶切鑒定；7. CD1031-1 494；8. pET-30a-CD1031-1 494；9. pET-30a-CD1031-1 494 PCR鑒定；10. pET-30a-CD1031-1 494 酶切鑒定；11. CD1031 435-2 931；12. pET-30a-CD1031 435-2 931；13. pET-30a-CD1031 435-2 931 PCR鑒定；14. pET-30a-CD1031 435-2 931酶切鑒定圖1 重組質(zhì)粒pET-30a-CD103的構(gòu)建

將CD1031-1 494和CD1031 435-2 931基因片段以及pET-30a(+)空質(zhì)粒酶切后，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取重組質(zhì)粒pET-30a-CD1031-1 494和pET-30a-CD1031 435-2 931后，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定。PCR鑒定結(jié)果顯示CD1031-1 494和CD1031 435-2 931基因片段大小在1 000～2 000 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相符。酶切鑒定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-30a-CD1031-1 494和pET-30a-CD1031 435-2 931經(jīng)酶切后存在兩條特異條帶，大小分別為1 500 bp和5 000 bp左右，pET-30a(+)空載體質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，結(jié)果顯示存在一條特異性條帶，大小為5 000 bp左右，符合預(yù)期。將經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET-30a-CD1031-1 494和pET-30a-CD1031 435-2 931留存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 CD103蛋白的原核表達(dá)及純化

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET-30a-CD1031-1 494和pET-30a-CD1031 435-2 931分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，將表達(dá)蛋白的菌體超聲裂解釋放蛋白，SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)形式。鑒定結(jié)果顯示所表達(dá)的CD1031-1 494和CD1031 435-2 931蛋白大小均約為70 kDa，與預(yù)期蛋白分子量大小一致，且目的蛋白均在沉淀中以包涵體形式表達(dá)，結(jié)果如圖2A所示。

將上述以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白溶解于8 mol/L尿素中，經(jīng)濃度逐級(jí)降低的尿素溶液透析出目的蛋白中尿素，最終獲得可溶性的目的蛋白，將溶解后的目的蛋白通過Ni-NTA親和層析的方式純化，并經(jīng)SDS-PAGE的方法檢測(cè)蛋白純化效果，結(jié)果顯示成功純化CD1031-1 494和CD1031 435-2 931蛋白，結(jié)果如圖2B所示。Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，純化后的CD1031-1494和CD1031435-2931蛋白條帶特異，大小正確，結(jié)果如圖2C所示。

M. 蛋白Marker；A. 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE；1為CD1031-1 494蛋白上清液，2為CD1031-1 494蛋白上清液，3為CD1031 435-2 931蛋白上清，4為CD1031 435-2 931蛋白沉淀；B. 蛋白純化后SDS-PAGE；1為PET-30(a)空載體蛋白，2為CD1031 435-2 931蛋白純化前，3為CD1031 435-2 931蛋白純化后，4為CD1031-1 494蛋白純化前，5為CD1031-1 494蛋白純化后；C. Western blot分析；1為CD1031 435-2 931蛋白，2為CD1031-1 494蛋白，3為pET-30(a)空載體蛋白圖2 CD103蛋白的原核表達(dá)

2.3 CD103多克隆抗體的制備

將純化后的CD103蛋白與弗氏佐劑混合并充分乳化，于背部皮下多點(diǎn)免疫BALB/c小鼠，收集每次免疫前后的小鼠血清，用純化后的CD103蛋白包被ELISA板，以間接ELISA的方法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)的變化。結(jié)果顯示，小鼠血清抗體效價(jià)隨著CD103蛋白免疫次數(shù)的上升而上升(見圖3A、圖3B)。在第3次免疫后第7天，用毛細(xì)管在小鼠眼球采血收集多克隆體，取適量血清，經(jīng)梯度稀釋后用間接ELISA的方法檢測(cè)血清抗體滴度。結(jié)果顯示，分段表達(dá)的CD103蛋白免疫小鼠制備的多克隆抗體在稀釋度達(dá)25 600倍時(shí)仍具有良好的反應(yīng)性(見圖3C、圖3D)。

A.免疫前后CD1031-1 494抗體；B.免疫前后CD1031 435-2 931抗體；C.CD1031-1 494抗體效價(jià)滴定；D.CD1031 435-2 931抗體效價(jià)滴定；數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”圖3 CD103多克隆抗體的制備及滴定

2.4 CD103多克隆抗體的功能驗(yàn)證

為驗(yàn)證所制備的CD103多克隆抗體的反應(yīng)性，將CD1031-2 931基因片段克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到CD1031-2 931目的基因，通過酶切、連接將目的基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示成功構(gòu)建pcDNA3.1-CD1031-2 931真核表達(dá)重組質(zhì)粒，結(jié)果如圖4A所示。為驗(yàn)證pcDNA3.1-CD1031-2 931真核表達(dá)重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CD1031-2 931和pcDNA3.1空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞并經(jīng)NP-40裂解，經(jīng)Western blot方法檢測(cè)CD1031-2 931蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示CD1031-2 931蛋白在HEK-293T細(xì)胞中成功表達(dá)，結(jié)果如圖4B所示。

A.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CD1031-2 931的構(gòu)建；M為DNA Marker，1為pcDNA3.1空載體，2為pcDNA3.1空載體酶切(EcoRⅠ、BamHⅠ)，3為pcDNA3.1-CD1031-2 931，4為pcDNA3.1-CD1031-2 931 PCR鑒定，5為pcDNA3.1-CD1031-2 931 酶切鑒定；B.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CD1031-2 931表達(dá)鑒定；1為pcDNA3.1-CD1031-2 931，2為pcDNA3.1圖4 CD1031-2931真核重組載體的構(gòu)建及Western blot鑒定

將上述驗(yàn)證表達(dá)的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CD1031～2 931轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，于48 h后收集細(xì)胞樣品，經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，分別以小鼠多克隆抗體、小鼠抗His標(biāo)簽抗體以及小鼠陰性血清作為一抗進(jìn)行孵育，之后以一抗所對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗孵育，經(jīng)Western blot的方法檢測(cè)小鼠多克隆抗體的反應(yīng)性，結(jié)果顯示，抗CD1031-1 494蛋白小鼠多克隆抗體反應(yīng)性良好，抗CD1031 435-2 931蛋白小鼠多克隆抗體不具有反應(yīng)性，結(jié)果如圖5A所示。同樣，將上述驗(yàn)證已表達(dá)的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CD1031-2 931轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后進(jìn)行IFA檢測(cè)，于轉(zhuǎn)染48 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，固定透膜后分別以小鼠抗His標(biāo)簽抗體以及小鼠多克隆抗體作為一抗孵育，以一抗相對(duì)應(yīng)的熒光二抗孵育，DAPI染色后于熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，抗CD1031-1 494蛋白小鼠多克隆抗體反應(yīng)性良好，抗CD1031 435-2 931蛋白小鼠多克隆抗體不具有反應(yīng)性，結(jié)果如圖5B所示。

A. Western blot驗(yàn)證；1為空細(xì)胞對(duì)照,2為pcDNA3.1,3為pcDNA3.1-CD1031-2 931;B. 間接免疫熒光驗(yàn)證圖5 CD103蛋白多克隆抗體反應(yīng)原性驗(yàn)證

3 討論

本研究應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CD1031～2 931蛋白，經(jīng)過反復(fù)的優(yōu)化溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，CD1031-2 931蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中仍舊不表達(dá)，分析其原因認(rèn)為，可能是因?yàn)槟康钠畏肿恿窟^大，導(dǎo)致蛋白表達(dá)困難。經(jīng)網(wǎng)站http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/預(yù)測(cè)，CD1031-2 931基因片段中可能存在抗原表位區(qū)域，在統(tǒng)計(jì)所有可能的抗原表位區(qū)域后，將CD1031-2 931分為了交叉重疊的兩個(gè)基因片段進(jìn)行分段表達(dá)。將CD1031-1 494和CD1031 435-2 931兩段基因片段分別克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+)，經(jīng)過優(yōu)化蛋白表達(dá)條件，最終兩段蛋白以包涵體的形式表達(dá)，解決了全長(zhǎng)蛋白在原核載體中不表達(dá)的問題。在原核表達(dá)過程中，重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)形式是決定蛋白結(jié)構(gòu)以及活性的主要因素[17]。在本研究中兩段蛋白以包涵體的形式表達(dá)，通過利用尿素溶解包涵體蛋白對(duì)蛋白進(jìn)行變性，再用濃度逐級(jí)減小的尿素溶液透析，得到具有一定活性的目的蛋白。免疫小鼠后收集血清，ELSA檢測(cè)結(jié)果顯示CD1031-1 494和CD1031 435-2 931蛋白均具有較好的免疫原性，可以有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗體。為驗(yàn)證本研究所制備多克隆抗體的應(yīng)用性，構(gòu)建了CD1031-2 931基因的真核表達(dá)載體，在293T細(xì)胞中表達(dá)CD1031-2 931蛋白。真核表達(dá)系統(tǒng)可以更好表達(dá)真核外源基因，蛋白質(zhì)的折疊以及糖基化修飾更為完善，具有自然狀態(tài)下的空間結(jié)構(gòu)[18]。在293T細(xì)胞中表達(dá)的CD1031-2 931蛋白，經(jīng)IFA與Western blot檢測(cè)，只與CD1031-1 494蛋白制備的多抗隆抗體有反應(yīng)性，而與CD1031 435-2 931蛋白制備的多克隆抗體不具有反應(yīng)性。這和CD1031 435-2 931自身的氨基酸組成有關(guān)，可能因?yàn)镃D1031-2 931蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)經(jīng)過了更為完整的修飾，而經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的CD1031 435-2 931蛋白都缺乏修飾，使得制備的多克隆抗體不能與修飾后的蛋白結(jié)合并產(chǎn)生反應(yīng)。

DCs因其捕獲以及遞呈抗原的優(yōu)異性成為了抗原遞呈細(xì)胞家族中最重要的一類。在免疫反應(yīng)過程中，DCs捕獲抗原后以MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子將加工處理后的抗原肽呈給T細(xì)胞，繼而活化B細(xì)胞激發(fā)免疫應(yīng)答[4, 19]。CD103+DCs作為一類具有遷移功能特性的DCs，其在黏膜上皮細(xì)胞下層可將突觸伸入黏膜表面攝取抗原，之后遷移至相關(guān)淋巴組織活化T細(xì)胞啟動(dòng)黏膜免疫應(yīng)答[20-21]。已有研究報(bào)道，小鼠呼吸道的CD103+DCs可使腸道產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答分泌sIgA，有效地將呼吸道和腸道黏膜組織聯(lián)系起來(lái)[22]。當(dāng)前CD103+DCs的研究集中于人與小鼠，對(duì)于豬機(jī)體CD103+DCs研究甚少。本研究成功克隆出豬樹突狀細(xì)胞表面分子CD103的編碼基因，經(jīng)蛋白表達(dá)免疫小鼠成功制備了CD103蛋白的多克隆抗體。該研究為后續(xù)制備豬樹突狀細(xì)胞表面分子CD103單克隆抗體奠定了前期基礎(chǔ)，為深入研究豬機(jī)體CD103+DC在黏膜免疫應(yīng)答中的功能提供了試驗(yàn)材料。