張韜，李茂林，鄒抒潔，Manita Aryal，劉光亮，付鈺廣

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046)

豬博卡病毒(porcine bocavirus，PBoV)于2009年由瑞典科學(xué)家在研究斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征時首次被發(fā)現(xiàn)，由于其基因序列與人博卡病毒基因序列具備較高的親緣相似性，因而將其以豬博卡病毒命名[1-2]。PBoV主要感染豬的呼吸道及腸道，引起感染豬只腹瀉和呼吸系統(tǒng)疾病，臨床中該病毒常與多種其他豬腸道病原混合感染，使豬腹瀉的防控難度大大增加，其中仔豬有較高的感染率和死亡率，該病毒對養(yǎng)豬業(yè)可造成一定的經(jīng)濟損失[3-4]。

PBoV屬于細小病毒科(Parvoviridae)細小病毒亞科(Parvovirinae)博卡病毒屬(Bocaparvovirus)成員[4-5]。該病毒是一種單鏈線性的DNA病毒，無囊膜，體積較小，結(jié)構(gòu)簡單，呈二十面體軸對稱[5-6]。病毒基因組包含3個開放閱讀框(ORF1、ORF2和ORF3)，轉(zhuǎn)錄翻譯4種蛋白質(zhì)VP1、VP2、NS1和NP1。根據(jù)相關(guān)研究，NS1、NP1比較保守，而VP1、VP2較易發(fā)生突變[7-8]。VP1和VP2相互重疊形成病毒的衣殼，VP1分布于病毒衣殼的外層，VP2位于病毒衣殼內(nèi)層[9-10]。有研究表明VP1蛋白與VP2蛋白相比，其在N端包含一個VP1蛋白獨有的蛋白區(qū)域，此區(qū)域在功能方面對細小病毒的感染起重要作用[11-12]。

目前，PBoV在中國的豬群中被大量檢出，其感染率可達到38%以上，分布廣泛[13]。但該病毒的入侵機制和相關(guān)生物學(xué)特性尚不明確。為深入研究該病毒的感染入侵特性，本研究利用大腸桿菌系統(tǒng)表達PBoV VP1蛋白，制備其多克隆抗體，為進一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

原核表達載體pET-28a(+)、真核載體pcDNA3.4購自優(yōu)寶生物，日本大耳白兔來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心，大腸桿菌感受態(tài)細胞 BL21(DE3)、DH5α均由本實驗室制備，DNA Marker、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，IPTG購自SIGMA，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ和KpnⅠ以及T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher公司，HRP標記的山羊抗兔IgG購自達科為生物有限公司，ISA206佐劑購自法國Seppic公司。Ni-NTA蛋白純化試劑購自GE公司。

1.2 VP1蛋白原核表達引物的設(shè)計與合成

在GenBank中獲得PBoV的基因組序列(序列號：MN481505.1)，根據(jù)將要構(gòu)建到的pET-28a(+)載體的多克隆位點設(shè)計針對VP1基因的原核表達引物：上游引物VP1-F：5′-CCGGAATTCATGAG TCATAAGCGCGGTCA-3′(酶切位點為EcoRⅠ)；下游引物VP1-R：5′-CCCAAGCTTTTACAG TACCTTCTCCCTCCCC-3′(酶切位點為HindⅢ)。擴增引物由西安擎科生物有限公司合成。

1.3 VP1蛋白重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

用特異性引物以PBoV的基因組為模板，進行PCR擴增，使用試劑盒進行VP1基因PCR產(chǎn)物的純化，接著配制酶切體系，用EcoRⅠ和HindⅢ對純化的VP1基因PCR產(chǎn)物與pET-28a(+)載體分別進行雙酶切，再用T4 DNA連接酶，將目的基因引入pET-28a(+)載體，將連接產(chǎn)物無菌操作轉(zhuǎn)化至DH5α后涂板，挑單個菌落至液體LB中增殖菌體，做菌液PCR鑒定，將鑒定陽性菌液進行測序鑒定并將重組質(zhì)粒命名為pET-28a-VP1。

1.4 VP1蛋白的原核表達和復(fù)性

將重組質(zhì)粒pET-28a-VP1轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中,，涂板后挑取單菌落至液體LB培養(yǎng)基進行37 ℃搖床培養(yǎng)增殖菌體，測OD600為0.6～0.8時，加入合適濃度IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)蛋白表達8 h。離心菌液并收集菌體，于冰浴中超聲裂解菌體，將離心超聲后的菌體分別保留上清液和沉淀，分裝適量的樣品，經(jīng)處理后加入SDS-PAGE膠進行電泳，經(jīng)SDS-PAGE鑒定蛋白是否表達。將超聲后的含有蛋白樣品的沉淀，用8 mol/L尿素充分溶解，用除菌濾器過濾，將過濾液置于提前處理好的規(guī)格合適的透析袋中，依次置于6 mol/L、4 mol/L和2 mol/L尿素的梯度透析液(0.1 mol/L NaH2PO4、0.01 mol/L Tris，pH值8.0)中，4 ℃條件下在各個梯度透析液中透析復(fù)性12 h，復(fù)性的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定。

1.5 VP1蛋白的純化

在親和層析柱中加入樹脂(HIS標簽)并對親和層析柱中的樹脂進行洗滌和平衡，將上述透析結(jié)束的蛋白加入純化柱，于4 ℃冰箱中過夜結(jié)合。之后將樣品自然流出，再用10倍柱體積的洗液洗滌樹脂，最后于層析柱中加入2 mL洗脫液室溫作用10 min并收集洗脫液，操作過程嚴格按照試劑盒說明書說進行。收集的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測其洗脫效率，同時經(jīng)Western blot鑒定蛋白純化效果。

1.6 動物免疫

將復(fù)性后的VP1蛋白與ISA206按1∶1體積的比例進行混合，將乳化后的抗原通過背部皮下多點注射對日本大耳白兔進行免疫，每只免疫500 μg，分別在初免2周后和4周后以相同的劑量對試驗兔進行第2次和第3次加強免疫。于各次免疫前后采集試驗兔耳緣靜脈血分離血清，做ELISA檢測針對VP1的抗體水平變化。收集最終免疫后的兔血清，與上述檢測方法一樣，孵育不同稀釋比的VP1多克隆抗體，以間接ELISA的方法檢測抗體滴度。

1.7 VP1基因重組真核表達載體的構(gòu)建

為驗證所制備的抗血清的反應(yīng)性，將VP1目的基因利用引物VP1-His-F：5′-CCGGGTACCAT GAGTCATAAGCGCGGTCAGT-3′(酶切位點為KpnⅠ)和VP1-His-R：5′-GGCAAGCTTTTAGTGGTGA TGGTGATGATGCAGTACCTTCTCCCTCCCC-3′(酶切位點為HindⅢ)進行擴增，酶切純化后克隆入真核表達載體pcDNA3.4，將重組質(zhì)粒按正確步驟轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，靜置、熱激后加入900 μL無抗LB增殖菌體，涂板后挑取單菌落到液體LB中搖菌，經(jīng)菌液PCR鑒定，對陽性菌液測序鑒定并將重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.4-VP1。

1.8 VP1蛋白的真核表達及鑒定

將空載體pcDNA3.4和重組質(zhì)粒pcDNA3.4-VP1用PEI轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染至準備好的HEK-293T細胞中，36 h后棄去細胞上清并加入NP-40裂解液裂解細胞，處理樣品后經(jīng)Western blot檢測蛋白表達。分別以His標簽抗體為一抗，以HRP標記的山羊抗小鼠IgG為二抗進行孵育，通過ECL發(fā)光試驗檢測目的蛋白的表達狀況。

1.9 VP1多克隆抗體的反應(yīng)性檢測

將空載體pcDNA3.4和重組質(zhì)粒pcDNA3.4-VP1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，36 h后，加入裂解液，收集并處理細胞樣品后，經(jīng)Western blot驗證制備的多克隆抗體與真核表達的VP1的反應(yīng)性。分別以制備的VP1多克隆抗體或His標簽抗體為一抗，以山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG抗體作為二抗孵育，通過ECL發(fā)光試驗驗證多抗的反應(yīng)性。此外，對轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.4或重組質(zhì)粒pcDNA3.4-VP1的HEK-293T細胞做間接免疫熒光試驗(IFA)，以多克隆抗體作為一抗，以Alexa Flour488山羊抗兔 IgG抗體為熒光二抗，加DAPI染料后于熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

1.10 VP1多克隆抗體反應(yīng)原性分析

為驗證制備的多克隆抗體與PBoV粒子的反應(yīng)性，用實驗室保存的PBoV感染的豬腸道內(nèi)容物灌服感染新生仔豬，待仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀后，采集仔豬小腸組織。取適量組織，其中一部分用于進行病毒的PCR檢測(引物：F: 5′-TGGATAATAATGAACAAG-GGGC-3′，R: 5′-TTCATTGCG GATAGGACACC-3′)，另一部分腸組織用組織冷凍劑包埋置于液氮中冷凍組織，然后利用冰凍切片機制備4 μm厚度的組織切片并貼附于載玻片上，經(jīng)固定、透膜和封閉處理后，以制備的VP1多克隆抗體或免疫前兔陰性血清作為一抗，Alexa Flour488山羊抗兔 IgG抗體為熒光二抗，加DAPI染料后于熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-28a-VP1的構(gòu)建及鑒定

對VP1基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳可見符合預(yù)期大小條帶(2 046 bp，見圖1A)。含有重組質(zhì)粒pET-28a-VP1的DH5α感受態(tài)細胞菌液經(jīng)菌液PCR核酸電泳鑒定，可看到2 000 bp左右與預(yù)期結(jié)果一致的條帶(見圖1B)。對pET-28a-VP1進行測序，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pET-28a-VP1中VP1基因序列與參考基因序列完全一致，證明已成功構(gòu)建pET-28a-VP1重組質(zhì)粒。

M. DNA Marker；A.PCR擴增；1為VP1；B.PCR鑒定；1為pET-28a(+)-VP1,2為pET-28a(+)-VP1圖1 VP1基因原核表達載體的克隆構(gòu)建及驗證

2.2 VP1蛋白的原核表達和復(fù)性

對本試驗的原核表達條件進行了探索，在37 ℃分別以IPTG濃度為0.1～0.8 mmol/L誘導(dǎo)蛋白表達8 h。 離心收集菌體，超聲裂解菌體離心后制備上清液和沉淀樣品，經(jīng)SDS-PAGE后，考馬斯亮蘭染色鑒定。結(jié)果表明：誘導(dǎo)后蛋白樣品存在于沉淀中而不在上清液中，在75 kDa左右出現(xiàn)符合預(yù)期大小的條帶(見圖2A和圖2B)；選取IPTG 濃度為0.6 mmol/L 誘導(dǎo)蛋白大量表達，鑒于VP1蛋白以包涵體形式表達，選擇尿素梯度透析法對VP1蛋白進行復(fù)性，經(jīng)SDS-PAGE分析，透析前后的VP1蛋白在75 kDa處條帶清晰(見圖2C)。

A. 不同濃度IPTG誘導(dǎo)蛋白表達；M為蛋白Marker，1、3、5、7為0、0.1、0.4、0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達后的上清液樣品，2、4、6、8為0、0.1、0.4、0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達后的沉淀樣品；B. 0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達；M為蛋白Marker，1、2為終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清液和沉淀樣品,3為pET-28a(+)載體)；C. 蛋白復(fù)性前后SDS-PAGE鑒定；M為蛋白Marker，1為VP1復(fù)性前，2為VP1復(fù)性后圖2 不同濃度IPTG誘導(dǎo)VP1蛋白表達的SDS-PAGE分析

2.3 VP1蛋白純化和鑒定

將上述透析后的目的蛋白通過Ni-NTA親和層析的方式純化，并經(jīng)SDS-PAGE的方法檢測蛋白純化效果。結(jié)果顯示已成功純化VP1蛋白，蛋白條帶約75 kDa，與預(yù)期相符(見圖3A)；純化的蛋白經(jīng)Western blot鑒定，結(jié)果顯示在75 kDa附近存在特異性條帶(見圖3B)。

A. 蛋白純化SDS-PAGE鑒定；B. 蛋白純化Western blot鑒定；M為蛋白Marker，1為pET-28a(+)空載體蛋白，2為純化后的VP1蛋白圖3 純化的VP1蛋白SDS-PAGE(A)和Western blot鑒定

2.4 VP1蛋白多克隆抗體的制備

將適量佐劑加入純化后的目的蛋白并充分混合乳化，對日本大耳白兔進行3次免疫，每次免疫前后，從實驗兔耳緣靜脈采血并分離血清，用VP1蛋白包被酶標板，通過ELISA分析檢測抗體滴度。結(jié)果顯示，VP1蛋白免疫后小鼠血清的抗體水平經(jīng)多次免疫后呈上升趨勢(見圖4A)。對最終收集的兔多克隆抗體進行滴度檢測，結(jié)果顯示，在稀釋至12 800倍時仍具有良好反應(yīng)性(見圖4B)。

A.VP1基因擴增；B.重組質(zhì)粒PCR鑒定;M. DNA Marker,1為VP1，2～6為pcDNA-3.4VP1;C.重組VP1的真核表達鑒定；1為pcDNA3.4-VP1，2為pcDNA3.4，3為HEK-293T圖5 VP1蛋白真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

2.5 VP1真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

用PCR方法成功擴增了VP1目的基因(見圖5A)，將其克隆入真核表達載體pcDNA3.4并經(jīng)PCR驗證，可以看到符合預(yù)期大小的條帶(見圖5B)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示與目的序列完全一致。將重組質(zhì)粒pcDNA3.4-VP1轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，Western blot鑒定結(jié)果顯示，VP1蛋白在HEK-293T細胞中成功表達(見圖5C)。

A.抗體水平變化;B.抗體滴度檢測；數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”圖4 VP1蛋白多克隆抗體的制備及滴度檢測

2.6 VP1多克隆抗體與真核表達蛋白的反應(yīng)性

為了驗證本研究所制備的多克隆抗體的反應(yīng)性，對轉(zhuǎn)染pcDNA3.4-VP1質(zhì)粒的HEK-293T細胞裂解液進行Western blot鑒定。分別以本研究制備的陰性兔血清、VP1多克隆抗體以及內(nèi)參抗體作為一抗，結(jié)果顯示，VP1多克隆抗體能與裂解液中的VP1蛋白發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生特異性條帶，而用陰性兔血清中由于沒有針對VP1的抗體產(chǎn)生，所以未能檢測到VP1蛋白(見圖6A)，說明本研究制備的VP1多抗特異性較高。同時，用IFA鑒定VP1多克隆抗體，將上述轉(zhuǎn)染的細胞進行固定，以VP1多克隆抗體和陰性兔血清作為一抗進行孵育。結(jié)果顯示，多克隆抗體試驗組可以檢測到明亮的綠色熒光信號，而陰性對照組未能檢測到熒光信號(見圖6B)。

A.Western blot 驗證；B. IFA驗證圖6 VP1多抗與真核表達的VP1蛋白反應(yīng)性分析

2.7 VP1多克隆抗體與組織感染病毒粒子的反應(yīng)性

為驗證本研究所制備多克隆抗體與PBoV粒子的反應(yīng)性，本研究提取感染PBoV豬只小腸組織DNA后進行PCR檢測，核酸電泳鑒定結(jié)果顯示，存在符合特異性引物所檢測基因分子量大小的特異性條帶，約為250 bp(見圖7A)；同時制備小腸組織冰凍切片，分別以VP1多克隆抗體和兔陰性血清進行孵育，經(jīng)IFA檢測，結(jié)果顯示VP1多克隆抗體組有較明顯熒光(見圖7B)，表明此次研究所制備的VP1多克隆抗體能與PBoV粒子反應(yīng)。

M. DNA Marker；1. 陰性對照；2. 陽性對照；3. 小腸組織圖7 豬小腸組織中PBoV的PCR檢測

圖8 組織中PBoV IFA驗證

3 討論

當(dāng)前許多大型養(yǎng)豬場都檢測到PBoV的流行，此病毒同時伴隨著斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征以及藍耳病暴發(fā)，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[2,14]。目前對PBoV的研究多集中在流行病學(xué)調(diào)查和檢測方法的建立，已報道的檢測方法有IFA、PCR和熒光定量PCR(qPCR)等[15-18]，但對該病毒的機理研究甚少。本研究制備了一種特異性較強的針對PBoV VP1蛋白的兔多克隆抗體，用于豬只感染PBoV的分析鑒定，為后期研究PBoV的感染特性及致病機理奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

VP1蛋白作為PBoV基因組編碼的主要衣殼蛋白，其在病原入侵過程中扮演重要角色，機體產(chǎn)生的針對該蛋白的抗體，可為宿主提供一定的針對該病毒的保護性[9]。有研究表明博卡病毒的VP1基因長度約2.1 kb，共編碼671個氨基酸，且包含一段5′端獨有的VP1-U序列，該序列是保守的“YXGXF”結(jié)構(gòu)域，大小約為387 bp，含有129個氨基酸，此區(qū)域含有的磷脂酸A2序列與病毒感染相關(guān)，對病毒DNA進入細胞核這一過程起關(guān)鍵作用，而目前對PBoV的VP1蛋白功能研究甚少[4]。本研究成功構(gòu)建了VP1蛋白的真核表達質(zhì)粒及制備了有效的多克隆抗體，為VP1蛋白的功能性研究提供了物質(zhì)材料。