楊炳雪，白玥，趙玉芬，娜美爾格，蘇布登格日勒*，李海軍*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎獸醫(yī)學重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

在哺乳動物中，卵母細胞成熟的質(zhì)量是保證其持續(xù)發(fā)育能力的必要前提。卵母細胞質(zhì)量在動物體外生產(chǎn)中非常重要[1]，其中體外模擬體內(nèi)卵母細胞成熟過程是一個關鍵環(huán)節(jié)。人們普遍認為，造成體外成熟(IVM)效率相對較低的部分原因，在于體外卵母細胞的核質(zhì)不同步成熟[2]。眾所周知，第二信使cAMP在維持哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂停滯中起著重要作用[3]。卵母細胞內(nèi)高濃度的cAMP，可以維持卵母細胞的減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，且其受磷酸二酯酶(PDE)和腺苷酸環(huán)化酶(AC)的調(diào)控，分別參與cAMP的降解和合成。越來越多的證據(jù)表明，在卵母細胞體外成熟過程中調(diào)節(jié)cAMP，可能是解決IVM的卵母細胞與體內(nèi)成熟的卵母細胞之間發(fā)育能力差異的一種方法[4]。通過在IVM過程中，使用PDE抑制劑西洛酰胺來防止卵丘卵母細胞復合體(COCs)中cAMP濃度降低[5]。

促性腺激素誘導cAMP水平的增加與卵泡中類固醇激素的增加有關[6]。動物體內(nèi)雌激素的活性以17β-雌二醇(E2)最高，具有廣泛的生理功能。長期以來，睪酮和E2一直被認為在卵母細胞的自發(fā)減數(shù)分裂恢復過程中發(fā)揮作用[7]。然而，在大鼠卵泡中發(fā)現(xiàn)，E2可誘導減數(shù)分裂激酶的活性，從而為有絲分裂調(diào)控卵泡發(fā)育提供了證據(jù)[8]。Soares等[9]研究也表明，E2與不同的因子聯(lián)合添加到卵母細胞IVM體系中，可以維持卵母細胞的減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，顯著增加生發(fā)泡(GV)期卵母細胞的比例。因此，推測E2可能參與維持卵母細胞的減數(shù)分裂停滯作用。

為了提高體外成熟培養(yǎng)卵母細胞的發(fā)育能力和質(zhì)量，研究人員提出了雙相體外成熟系統(tǒng)，在成熟前對cAMP進行調(diào)節(jié)，即在IVM前期添加PDE抑制劑與/或AC激動劑[10]。相對于常規(guī)IVM，雙相IVM系統(tǒng)使卵母細胞發(fā)育能力得到改善[11]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠[12]、山羊[13]、綿羊[14]、人[15]等的卵母細胞在雙相IVM系統(tǒng)的培養(yǎng)下，發(fā)育潛能均有提高。故此，在體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)中探討與應用高效cAMP促進劑已成為研究熱點。本研究首先在常規(guī)體外成熟培養(yǎng)體系中，測定了PDE3的抑制劑西洛酰胺的作用效果，隨后在雙相體外成熟系統(tǒng)添加高低濃度E2和/或西洛酰胺，探討其對綿羊COCs內(nèi)cAMP水平以及卵母細胞減數(shù)分裂恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TCM-199(tissue culture medium-199)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司；雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)和卵泡雌激素(FSH)購自寧波第二激素廠；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、PBS、DAPI染色液、石蠟油、BSA、透明質(zhì)酸酶和凡士林均購自Sigma公司；ELISA試劑盒購自Cayman公司；西洛酰胺購自Med Chem Express公司。

1.2 綿羊COCs采集

在呼和浩特市某屠宰場，采集選取約6～8月齡的小尾寒羊卵巢，置于30～35 ℃的生理鹽水中，于3 h內(nèi)帶回實驗室，采用剖割法劃取卵巢表面2～6 mm的卵泡獲取綿羊COCs，并在立式顯微鏡下，選取3層以上致密的卵丘細胞層及卵胞質(zhì)均勻的COCs，進行體外成熟培養(yǎng)。

1.3 綿羊COCs的體外成熟培養(yǎng)

在四孔板中分別加入或不加入10 μmol/L 西洛酰胺的成熟液(9.70 mg/mL TCM199+10%FBS+2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸鈉+0.02 U/mL FSH+0.12 U/mL LH+1 μg/mL E2)，將COCs隨機平分到四孔板中，放入39 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，進行體外成熟培養(yǎng)，在不同時間(0 h、30 min、1 h、2 h)，分別測定綿羊卵母細胞與卵丘細胞內(nèi)cAMP水平。

1.4 綿羊COCs的雙相體外成熟培養(yǎng)

在四孔板中分別加入：成熟液(9.70 mg/mL TCM199+10%FBS+2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸鈉+0.02 U/mL FSH+0.12 U/mL LH+1 μg/mL E2)，0.5 ng/mL E2，1 μg/mL E2，10 μmol/L 西洛酰胺的預成熟液(處理組加，對照組不加)，預成熟液為9.70 mg/mL TCM199 +2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸鈉+1 mg/mL無脂肪酸BSA。將COCs隨機平分到四孔板中，放入39 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中進行體外成熟培養(yǎng)。在0 h和2 h，分別測定綿羊卵母與卵丘細胞內(nèi)cAMP水平；2 h后將COCs轉(zhuǎn)移至正常成熟液的四孔板中，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h后，檢測生發(fā)泡破裂(GVBD)發(fā)生情況。

1.5 綿羊卵母與卵丘細胞cAMP水平測定

1.5.1 綿羊卵母與卵丘細胞樣品的制備

體外成熟培養(yǎng)不同時間后，取出四孔板，在0.3%透明質(zhì)酸酶中分離獲得卵母細胞和卵丘細胞，隨后在0.1 mol/L HCl中靜置裂解30 min。裂解完成后吹打，1 000 r/min離心10 min，上清液用ELISA Buffer稀釋，渦旋離心2次后，分別獲得卵母與卵丘細胞樣品，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 競爭ELISA檢測

按照ELISA試劑盒說明書進行操作。依次定量加入ELISA Buffer、標準品、樣品、cAMP乙酰膽堿酯酶示蹤劑和抗血清后，在4 ℃中孵育18 h，用Wash Buffer清洗拍干；再將Ellman’s試劑和Tracer加入指定孔中，室溫條件下?lián)u床避光孵育90～120 min；多功能酶標儀在412 nm波長下檢測OD值，以標準物濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣本中的cAMP水平。

1.6 DAPI染色

培養(yǎng)結束的COCs，置于含有0.3%透明質(zhì)酸酶中孵育5 min，移液槍反復吹打至裸卵，將其轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中，4 ℃過夜固定。固定完成后，用PBS洗滌3次，將裸卵轉(zhuǎn)移至載玻片，在蓋玻片上滴注粘片劑，進行壓片至卵母細胞充滿卵周隙，1%Triton透化15 min，PBS洗滌卵母細胞，1 μg/mL的DAPI避光染色10 min，然后PBS再洗3次。在熒光顯微鏡下觀察卵母細胞核狀態(tài)，并記錄每組GV期卵母細胞率、GVBD期卵母細胞率和MⅠ期卵母細胞率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗均至少重復3次，用Excel軟件初步整理試驗數(shù)據(jù)，再用ELISA Calc.exe和GraphPad Prism 5.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗結果用“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 西洛酰胺對綿羊卵母細胞和卵丘細胞內(nèi)cAMP的影響

2.1.1 cAMP標準曲線

采用競爭ELISA法檢測綿羊卵母細胞與卵丘細胞裂解物中cAMP水平，結果顯示R2值為0.999 82，表明西洛酰胺含量與cAMP測定值具有良好的相關性，cAMP水平檢測的標準曲線見圖1。

圖1 添加西洛酰胺的cAMP標準曲線

2.1.2 西洛酰胺對綿羊卵母細胞與卵丘細胞內(nèi)cAMP水平的影響

試驗測定了PDE3抑制劑西洛酰胺(10 μmol/L)對體外成熟后綿羊卵母細胞與卵丘細胞內(nèi)cAMP水平變化的時間效應，結果見圖2。

A. 卵母細胞cAMP水平；B. 卵丘細胞cAMP水平；每組10個COCs至少重復3次；同組之間比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同；*表示相同時間點組間差異顯著(P<0.05)，**表示相同時間點組間差異極顯著(P<0.01)；圖2 西洛酰胺對綿羊卵母細胞和卵丘細胞中cAMP水平的影響

由圖2可見，對照組和處理組卵母細胞體外培養(yǎng)30 min、1 h與2 h，cAMP水平均極顯著高于0 h(P<0.01)。與對照組比較，處理組卵母細胞內(nèi)cAMP水平均有升高，其中30 min與2 h組分別顯示極顯著差異(P<0.01)與顯著差異(P<0.05)(圖 2A)；而卵丘細胞內(nèi)cAMP水平在30 min與2 h時，對照組和處理組中均無明顯變化，但添加處理1 h時，卵丘細胞內(nèi)cAMP水平與對照組相比顯著升高(P<0.05)(圖2B)。

2.2 雌二醇與西洛酰胺預處理對綿羊COCs內(nèi)cAMP水平的影響

2.2.1 cAMP標準曲線

采用競爭ELISA法檢測綿羊卵母細胞與卵丘細胞裂解物中cAMP水平，cAMP水平檢測的標準曲線見圖3。試驗結果顯示，R2值為0.999 72，表明各試驗組預處理與cAMP測定值具有良好的相關性。

圖3 E2與西洛酰胺預處理的cAMP標準曲線

2.2.2 雌二醇與西洛酰胺預處理對綿羊COCs內(nèi)cAMP水平的影響

添加不同濃度E2(0.5 ng/mL或1 μg/mL)和西洛酰胺(10 μmol/L)體外預成熟培養(yǎng)2 h后，分別檢測綿羊卵母與卵丘細胞內(nèi)cAMP水平，結果見圖4。在卵母細胞中，正常對照組，與0 h對照組cAMP水平相同，而預處理對照組的cAMP水平降低近1/2，無顯著性差異(P>0.05)。與預處理對照組相比，西洛酰胺組、0.5 ng/mL E2組和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2、西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平均明顯升高，且聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平最高，與預處理對照組相比差異顯著(P<0.05)；1 μg/mL E2組相比于預處理對照組，cAMP水平略有升高，但差異不顯著(P>0.05)， 見圖4A。

在卵丘細胞中，與正常對照組相比，0 h對照組cAMP水平略低，而預處理對照組的cAMP水平降至約1/2水平，與預處理對照組相比，西洛酰胺組、0.5 ng/mL E2組和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平均顯著升高(P<0.05)，且均與預處理對照組有顯著差異(P<0.05)，而聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)相對于預處理對照組，其cAMP水平略有升高，而1 μg/mL E2組cAMP水平略微降低，但差異均不顯著(P>0.05)；另外，聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平相對于西洛酰胺組略有降低，而相對于1 μg/mL E2組cAMP水平略有升高，表明聯(lián)合添加可能存在拮抗效應，而聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平相對于西洛酰胺組和0.5 ng/mL E2均有升高，表明聯(lián)合添加可能存在累加效應，見圖4B。

A. 卵因細胞cAMP水平；B. 卵丘細胞cAMP水平；Cil是西洛酰胺的簡稱圖4 E2與西洛酰胺預處理COCs對cAMP水平的影響

2.3 雌二醇與西洛酰胺預處理COCs對綿羊卵母細胞核成熟的影響

為了驗證cAMP水平變化對綿羊卵母細胞減數(shù)分裂進程的影響，試驗利用DAPI染色技術，觀察并記錄了處于GV、GVBD及MⅠ期卵母細胞核的狀態(tài)特征，觀察結果見圖5。GV期：染色質(zhì)呈絮狀、絲狀，可觀察到完整的核膜(圖5A)；GVBD期：核膜破裂，染色體高度濃縮，呈四分體形態(tài)(圖5B)；MⅠ期：染色體清晰可見，整齊地排列在赤道板上(圖5C)。

A. GV期；B. GVBD期；C. MⅠ期圖5 綿羊卵母細胞GV、GVBD及MⅠ核狀態(tài)

在雙相體外成熟系統(tǒng)中，測定不同濃度E2(0.5 ng/mL和1 μg/mL)和西洛酰胺(10 μmol/L)單獨或聯(lián)合添加對綿羊卵母細胞GVBD發(fā)生的影響，結果見表1。各組在體外預成熟培養(yǎng)2 h和常規(guī)成熟培養(yǎng)4 h后，正常對照組GV期卵母細胞率為62.9%，預處理對照組與正常對照組相比，GV期略有上升但差異不明顯(P>0.05)。與預處理對照組相比，西洛酰胺組、0.5 ng/mL E2和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)GV期卵母細胞率顯著升高(P<0.05)，GVBD期卵母細胞率顯著降低(P<0.05)。1 μg/mL E2組和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)與預處理對照組、0.5 ng/mL E2組和西洛酰胺組及聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)比較，1 μg/mL E2組、西洛酰胺組與聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)之間卵母細胞各期比率無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 E2與西洛酰胺預處理COCs對綿羊卵母細胞核成熟的影響

3 討論

近年來關于家畜卵母細胞體外成熟技術改良已取得諸多進展，但卵母細胞體外成熟的效率仍低于體內(nèi)成熟，這使得由體外成熟而來的家畜體外胚胎仍難以在育種實踐中被廣泛應用[16]。當前研究表明，cAMP調(diào)節(jié)劑在核成熟過程中發(fā)揮關鍵作用[17-18]，因為cAMP是參與減數(shù)分裂停滯和恢復的基本因素，它與進一步的發(fā)育能力有關。

實驗室前期的研究顯示，在體外成熟培養(yǎng)中，添加10 μmol/L西洛酰胺的效果最好[19]，因此，本研究在常規(guī)成熟體系中添加10 μmol/L的西洛酰胺，試圖探討其在含促性腺激素等在內(nèi)的體外成熟體系中，其對綿羊卵母細胞與卵丘細胞內(nèi)cAMP含量的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，分別添加西洛酰胺處理30 min與2 h時，可顯著提高卵母細胞內(nèi)cAMP水平。這與Buell等[20]研究結果相一致。在卵母細胞IVM期，添加Forskolin和IBMX處理30 min時，cAMP水平達到峰值。西洛酰胺是PDE3的特異性抑制劑[21]，但本試驗發(fā)現(xiàn)在1 h時，西洛酰胺也可以顯著提高卵丘細胞內(nèi)cAMP水平。這可能是由于前人與本試驗研究的時間有所差異，或者是由于卵母細胞與卵丘細胞之間的縫隙連接開放[22]，從而導致卵母細胞內(nèi)cAMP流向卵丘細胞，使卵丘細胞內(nèi)cAMP水平有所增加。

在上述試驗的基礎上，本試驗在雙相IVM中的預處理階段添加10 μmol/L 西洛酰胺和不同濃度的E2(0.5 ng/mL和1 μg/mL)后，發(fā)現(xiàn)0 h對照組與正常對照組相比，卵母細胞cAMP水平相同，而預處理對照組降至約1/2水平，說明上述外源性激素可能具有維持卵母細胞內(nèi)cAMP水平的作用。對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，促性腺激素具有維持卵母細胞內(nèi)cAMP水平的作用[23]。在常規(guī)體外成熟培養(yǎng)6 h后，GV期卵母細胞率為62.9%，與Ni等[24]研究發(fā)現(xiàn)基本一致，其GV期卵母細胞率為67.2%。另外，與預處理對照組相比，西洛酰胺組cAMP水平顯著升高, 與本研究的結果相類似。Park等[25]研究發(fā)現(xiàn)，用西洛酰胺預處理豬COCs，可顯著提高卵母細胞的cAMP水平。另外，與預處理對照組相比，西洛酰胺組GV期卵母細胞率顯著升高，GVBD期顯著降低。Gharibi等[26]研究發(fā)現(xiàn)，西洛酰胺能夠明顯阻滯體外成熟培養(yǎng)的綿羊卵母細胞減數(shù)分裂恢復。相對于預處理對照組，0.5 ng/mL E2組的cAMP水平和GV期卵母細胞率顯著升高，而GVBD期顯著降低；而1 μg/mL E2組的cAMP水平、GV期卵母細胞率與對照組及GVBD期差異不顯著。蔡姣[27]和張駿鴻[28]研究發(fā)現(xiàn)與本試驗結果相似，添加低濃度(0.27 ng/mL或2.7 ng/mL)E2，可顯著促進GV期卵母細胞率，而高濃度(1 μg/mL)E2，可顯著降低GV期卵母細胞率。此外，本試驗聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)與預處理對照組相比，其cAMP水平與GV期卵母細胞率呈顯著差異，均高于單獨添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2組，表明聯(lián)合添加可能起到累加效應。與預處理對照組相比，聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平明顯升高，且與0 h對照組呈顯著性差異，但其GV期卵母細胞率無顯著差異，表明高濃度雌激素與西洛酰胺聯(lián)合添加未起到最佳效果。而在卵丘細胞中顯示，與預處理對照組相比，西洛酰胺組、0.5 ng/mL E2組和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)均顯著提高cAMP水平，聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)顯示最優(yōu)效果，且與0 h對照組呈顯著性差異。在目前的文獻中，尚未發(fā)現(xiàn)西洛酰胺和E2聯(lián)合添加的試驗，這也是本試驗的創(chuàng)新點之一。綜上，本研究在雙相體外成熟系統(tǒng)的預成熟階段，添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2，然后進行常規(guī)IVM培養(yǎng)，促進卵母細胞的核質(zhì)同步成熟，進而提高后續(xù)胚胎的發(fā)育能力。

4 結論

在IVM培養(yǎng)時添加西洛酰胺可以提高體外成熟綿羊卵母細胞內(nèi)cAMP水平；利用西洛酰胺和0.5 ng/mL E2構建綿羊卵母細胞體外“雙階段”成熟培養(yǎng)體系。在雙相IVM系統(tǒng)中，單獨或者聯(lián)合添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2預成熟培養(yǎng)2 h，能夠顯著提升卵母細胞內(nèi)cAMP水平，阻滯減數(shù)分裂進程，對改善卵母細胞體外成熟質(zhì)量具有積極作用。