董雨豪，徐艷楠，聶蒙，曹青，姬姝婷，劉廣錦，劉永杰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，又稱B群鏈球菌(Group BStreptococcus, GBS)，可引起奶牛乳腺炎、腦膜炎及新生兒敗血癥，也可導(dǎo)致魚類鏈球菌病，是一種感染宿主范圍較廣的病原菌[1]。自2009年以來，我國(guó)南方多個(gè)省市的羅非魚養(yǎng)殖場(chǎng)大規(guī)模暴發(fā)無乳鏈球菌病，由于感染魚死亡率極高，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至給羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了毀滅性打擊。病魚常見癥狀主要有：精神萎靡、眼球突出、腹部膨大、軀體平衡喪失并狂游[2]。該菌的致病性與多種毒力因子密切相關(guān)，如β-溶血素、CAMP因子、莢膜多糖和C5a肽酶等[3]。雖然對(duì)無乳鏈球菌毒力因子已進(jìn)行了大量研究，但其確切的致病機(jī)制尚不清楚。

肽聚糖是革蘭陽性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，在維持細(xì)胞完整性、防止細(xì)胞在低滲溶液中脹裂等方面起重要作用[4]。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，肽聚糖會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)重構(gòu)，其過程需要肽聚糖水解酶的參與。肽聚糖水解酶主要功能是切割肽聚糖層，將新合成的肽聚糖插入其中，以維持肽聚糖的循環(huán)利用[5]。肽聚糖水解酶根據(jù)其作用位點(diǎn)差異，可分為三大類：切割多糖骨架的糖苷酶、切割側(cè)鏈肽的酰胺酶以及切割側(cè)鏈多肽內(nèi)部的肽鏈內(nèi)切酶[6]。肽聚糖水解酶幾乎參與了細(xì)胞的整個(gè)生長(zhǎng)過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分離、自溶、細(xì)胞壁翻轉(zhuǎn)等。另外，肽聚糖水解酶在細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、蛋白分泌以及致病性方面也發(fā)揮重要作用[4]。在細(xì)胞壁重構(gòu)過程中，肽聚糖水解酶還可以通過修剪細(xì)胞壁，消除宿主天然免疫受體所能識(shí)別的肽聚糖片段，進(jìn)而抑制宿主免疫應(yīng)答。例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)肽聚糖水解酶Atl通過修剪細(xì)胞壁表面裸露的肽聚糖末端，導(dǎo)致細(xì)菌不能被宿主的肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRPs)識(shí)別，從而使細(xì)菌成功入侵宿主[7]。肽聚糖水解酶在無乳鏈球菌中的研究相對(duì)較少，目前僅有一種肽聚糖水解酶PcsB被鑒定[8]。

本研究在無乳鏈球菌GD201008-001基因組中預(yù)測(cè)到一個(gè)可能的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(A964_0097，命名為nalA)，采用同源重組技術(shù)構(gòu)建基因缺失株及互補(bǔ)株，并研究該基因敲除后細(xì)菌形態(tài)變化、自溶能力以及對(duì)斑馬魚致病力的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與試劑

魚源無乳鏈球菌GD201008-001分離自廣州肇慶羅非魚養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)病羅非魚。大腸桿菌DH5α購(gòu)于南京諾維贊生物技術(shù)有限公司；溫敏型自殺質(zhì)粒pSET4s (壯觀霉素抗性，大小為4 506 bp)和穿梭質(zhì)粒pSET2(壯觀霉素抗性，大小為5 016 bp)由本實(shí)驗(yàn)室保存；無乳鏈球菌培養(yǎng)條件為Todd-Hewitt broth (THB)液體培養(yǎng)基、溫度37 ℃。大腸桿菌DH5α培養(yǎng)條件為L(zhǎng)uria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基、溫度37 ℃。

PrimeSTAR Max DNA聚合酶、2×PCR PreMix、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒均購(gòu)自南京諾維贊生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、DNA純化回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌RNA/DNA提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；壯觀霉素購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。Triton X-100、Tris-HCl、三卡因甲基磺酸鹽等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。試?yàn)相關(guān)引物(表1)均為自行設(shè)計(jì)并由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 蛋白生物信息學(xué)分析

檢索無乳鏈球菌GD201008-001基因組(NC_018646),發(fā)現(xiàn)A964_0097被注釋為N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，命名為nalA。采用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/) 軟件和SMART(http://smart.emblheidelberg. de/)軟件對(duì)該基因進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，采用I-TASSER(https://zhanggroup.org//I-TASSER/)軟件進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)建模。

1.3 基因缺失株構(gòu)建

以GD201008-001菌株基因組為模板，對(duì)nalA基因上下游同源臂進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物分別為nalA-A/B和nalA-C/D。產(chǎn)物再用nalA-A/D引物進(jìn)行同源臂融合。融合PCR產(chǎn)物連接至pSET4s中，構(gòu)建的nalA基因缺失重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。將10 μL濃度為200 ng/μL的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至無乳鏈球菌GD201008-001感受態(tài)中，電轉(zhuǎn)儀參數(shù)設(shè)置為：200 Ω、2.3 kV/cm、25 μF。電轉(zhuǎn)液置于28 ℃培養(yǎng)4 h，加入壯觀霉素，終濃度為100 μg/mL， 28 ℃培養(yǎng)過夜。

取適量菌液涂布至THB平板(含100 μg/mL壯觀霉素)，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種至THB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL壯觀霉素)中，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后按1∶100體積比轉(zhuǎn)接至THB液體培養(yǎng)基中，每8 h傳代一次。連續(xù)傳代5次后，取等量稀釋菌液分別涂布于抗性和非抗性平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。當(dāng)抗性平板上菌落數(shù)量明顯少于非抗性平板上的菌落時(shí)，說明雙交換已發(fā)生，可挑取非抗性平板上的菌落，分別劃線于抗性和非抗性平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。選取在僅在非抗性平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。缺失株用nalA-1/2引物對(duì)缺失基因上下游ORF進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序，以確定nalA基因的缺失是否導(dǎo)致上下游ORF的移碼。

1.4 基因互補(bǔ)株構(gòu)建

以GD201008-001基因組為模板，利用引物CnalA-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得nalA片段，產(chǎn)物連接至pSET2載體，電轉(zhuǎn)化至ΔnalA缺失株感受態(tài)中。后續(xù)步驟同基因敲除。

1.5 細(xì)菌形態(tài)觀察

采用革蘭染色法將無乳鏈球菌野生株、ΔnalA和CΔnalA進(jìn)行染色，在100倍油鏡下觀察菌體形態(tài)、成鏈長(zhǎng)度和染色特性，并拍照記錄。

1.6 細(xì)菌自溶試驗(yàn)

參照Yamada[9]方法進(jìn)行細(xì)菌自溶試驗(yàn)。將野生株、ΔnalA及CΔnalA培養(yǎng)至OD600=0.6，5 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體重懸于50 mmol/L含0.05% Triton X-100的Tris-HCl 溶液(pH=7.0)中，調(diào)至OD600=0.6。37 ℃輕微振蕩孵育，每隔4 h使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度OD600值。按照如下公示進(jìn)行細(xì)菌自溶能力計(jì)算：

1.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

野生株、ΔnalA及CΔnalA生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)至OD600=0.5，按1∶100轉(zhuǎn)接至50 mL THB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。每隔1 h使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.8 半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，并經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SYXK(Su)2017-0007)。各菌株接種于THB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。5 000 r/min離心5 min，PBS洗3次。調(diào)整濃度至5×104、2.5×104、5×103、2.5×103CFU/mL。每組15尾斑馬魚。斑馬魚先用100 μg/mL三卡因甲基磺酸鹽(MS-222)進(jìn)行浸泡麻醉，然后用胰島素注射器每尾腹腔注射20 μL菌液，空白對(duì)照注射等量PBS。觀察1周記錄結(jié)果，按Bliss法[10]計(jì)算LD50。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行分析處理，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。*表示差異顯著，P<0.05; **表示差異極顯著，P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 NalA蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用PRABI軟件對(duì)NalA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示52～186位氨基酸殘基為G73氨基葡糖苷酶結(jié)構(gòu)域 (圖1A)。通過I-TASSER進(jìn)行同源建模后得到NalA蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示 C 端催化結(jié)構(gòu)域由1個(gè)β發(fā)卡結(jié)構(gòu)和7個(gè)α螺旋構(gòu)成，其中催化活性位點(diǎn)Glu115位于β發(fā)卡結(jié)構(gòu)中(圖1B)。通過蛋白結(jié)構(gòu)分析推測(cè)該蛋白為糖苷水解酶G73家族中的一種肽聚糖水解酶?；贐LAST比對(duì)結(jié)果，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于NalA氨基酸序列的進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，無乳鏈球菌GD201008-001的NalA與S.agalactiaeFSL S3-026的肽聚糖水解酶(登錄號(hào)：WP_001231505.1)同源關(guān)系較近，且氨基酸序列相似性為99.48%(圖2)。

A. 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B. 二維結(jié)構(gòu)圖1 NalA蛋白結(jié)構(gòu)分析

圖中方框內(nèi)所示為本研究蛋白NalA圖2 NalA氨基酸序列進(jìn)化樹分析

2.2 nalA基因缺失株及互補(bǔ)株的PCR鑒定

用引物nalA-A/D對(duì)野生株和ΔnalA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，野生株可檢測(cè)到長(zhǎng)度為2 285 bp的產(chǎn)物，即目的基因片段及上下游片段長(zhǎng)度。缺失株擴(kuò)增片段為1 317 bp，即目的基因上下游片段長(zhǎng)度。同時(shí)，使用目的基因內(nèi)部引物nalA-F/R進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示野生株可檢測(cè)到目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，而缺失株未檢測(cè)到目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，以上結(jié)果表明nalA基因缺失株構(gòu)建成功(圖3A)。另外，用nalA-1/2引物對(duì)缺失基因上下游ORF進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示nalA基因的缺失未導(dǎo)致上下游ORF的移碼。用nalA基因內(nèi)部引物nalA-E/F進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示在互補(bǔ)株中可檢測(cè)到目的基因，說明nalA基因成功回補(bǔ)(圖3B)。

A．缺失株P(guān)CR鑒定；M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (DL 5000)；1為野生株，引物為nalA-F/R；2為野生株，引物為nalA-A/D；3為缺失株，引物為nalA-F/R；4為缺失株，引物為nalA-A/DB．互補(bǔ)株P(guān)CR鑒定；M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (DL 2000)；1為野生株，引物為CnalA-F/R；2為互補(bǔ)株，引物為CnalA-F/R圖3 nalA基因缺失株及互補(bǔ)株P(guān)CR鑒定

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證nalA基因轉(zhuǎn)錄水平

采用qRT-PCR對(duì)野生株、ΔnalA和CΔnalA進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)錄情況驗(yàn)證。結(jié)果顯示，ΔnalA無目的基因轉(zhuǎn)錄(P<0.01)，而野生株和CΔnalA均能檢測(cè)到目的基因的轉(zhuǎn)錄，且nalA基因的缺失不影響上下游基因的轉(zhuǎn)錄(圖4)。

***表示差異極顯著(P<0.01)圖4 nalA基因缺失株及互補(bǔ)株qRT-PCR鑒定

2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制野生株、ΔnalA缺失株與CΔnalA互補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線。如圖5所示，與野生株相比，ΔnalA缺失株的生長(zhǎng)速率在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期有明顯下降，但達(dá)到平臺(tái)期所用時(shí)間一致，CΔnalA互補(bǔ)株的生長(zhǎng)能力與野生株基本相同。

圖5 野生株、ΔnalA及CΔnalA生長(zhǎng)曲線

2.5 菌株的自溶測(cè)定

通過測(cè)定菌液OD值評(píng)估各菌株的自溶能力，結(jié)果顯示，前4 h，ΔnalA的自溶程度與野生株基本相同，4 h后ΔnalA的自溶程度開始放緩，基本沒有繼續(xù)發(fā)生自溶，而野生株的自溶程度直到16 h后才明顯放緩(圖6)，24 h時(shí)，ΔnalA的自溶能力降低69.36%。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，nalA基因的缺失可顯著降低細(xì)菌自溶的發(fā)生(P<0.01)。

**表示差異極顯著，P<0.01圖6 野生株、ΔnalA及CΔnalA自溶能力

2.6 細(xì)菌形態(tài)觀察

野生株、ΔnalA及CΔnalA革蘭染色后顯微鏡下觀察：3個(gè)菌株形態(tài)均為球狀，排列成鏈狀；與野生株(圖7A)相比，ΔnalA缺失株(圖7B)的細(xì)菌鏈增長(zhǎng)約10倍，而CΔnalA互補(bǔ)株(圖7C)的細(xì)菌鏈長(zhǎng)恢復(fù)到接近野生株水平。

A. 野生株；B. ΔnalA缺失株； C. CΔnalA互補(bǔ)株圖7 野生株、ΔnalA缺失株和CΔnalA互補(bǔ)株的形態(tài)學(xué)比較

2.7 對(duì)斑馬魚的LD50

如表2所示，野生株對(duì)斑馬魚的LD50為1.31×102CFU，ΔnalA對(duì)斑馬魚的LD50為5.87×102CFU，與野生株相比升高約4倍。回補(bǔ)nalA后，LD50恢復(fù)至野生株水平。結(jié)果表明nalA的缺失減弱了無乳鏈球菌對(duì)斑馬魚的致病力。

表2 斑馬魚致病性試驗(yàn)

3 討論

本研究首先對(duì)無乳鏈球菌可能的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NalA進(jìn)行二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示NalA的催化結(jié)構(gòu)域由1個(gè)β發(fā)卡結(jié)構(gòu)和7個(gè)α螺旋構(gòu)成，且催化活性位點(diǎn)位于β發(fā)卡結(jié)構(gòu)中，此結(jié)構(gòu)與肽聚糖水解酶LytB[11]和自溶素Auto[12]的催化結(jié)構(gòu)非常相似，表明這3種糖苷水解酶可能具有相同的底物結(jié)合方式和催化機(jī)制。為進(jìn)一步明確其功能，利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建該基因缺失株ΔnalA及互補(bǔ)株CΔnalA，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析，證實(shí)ΔnalA的生長(zhǎng)速率在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期有明顯下降。有研究報(bào)道，金黃色葡萄球菌的胞壁質(zhì)水解酶LytN缺陷可延緩細(xì)菌的生長(zhǎng)[13]；糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的胞壁質(zhì)水解酶可降解環(huán)境中的高甘露糖型糖蛋白，釋放單糖促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)[14]，推測(cè)本研究鑒定的NalA可通過降解生長(zhǎng)環(huán)境中的某些物質(zhì)，為無乳鏈球菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的迅速增殖提供營(yíng)養(yǎng)。

當(dāng)處于脅迫環(huán)境時(shí)，細(xì)菌會(huì)發(fā)生自溶現(xiàn)象。自溶現(xiàn)象是菌體在脅迫環(huán)境下維持生存的一種自我保護(hù)行為。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶屬于肽聚糖水解酶的一種, 與細(xì)菌自溶存在密切聯(lián)系[15]。本研究中ΔnalA的自溶能力顯著降低，說明該基因參與無乳鏈球菌的自溶過程。但nalA基因的缺失并未導(dǎo)致菌體自溶的停止, 表明無乳鏈球菌的自溶受到多種酶的調(diào)節(jié), 而NalA可能只是其中關(guān)鍵的自溶酶。自溶酶不僅影響菌體的自溶, 而且決定著菌體的形態(tài)。革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)ΔnalA菌體形態(tài)與野生株無明顯差異，均為球形，但其排列成鏈的長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于野生株，說明NalA是無乳鏈球菌細(xì)胞分散所必需的肽聚糖水解酶, 可能主要通過切割子代細(xì)胞與母代細(xì)胞細(xì)胞壁的連接實(shí)現(xiàn)二者的分離。類似的現(xiàn)象在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)[16]和乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)[17]也有報(bào)道。在戈登鏈球菌(Streptococcusgordonii)中發(fā)現(xiàn)，肽聚糖水解酶lytB基因的缺失同樣可導(dǎo)致細(xì)菌鏈的增長(zhǎng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)nalA的缺失導(dǎo)致無乳鏈球菌對(duì)斑馬魚的致病力顯著降低，推測(cè)NalA可能通過破壞細(xì)胞壁內(nèi)肽聚糖的化學(xué)鍵，導(dǎo)致細(xì)胞表面特性(細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、電荷、表面修飾)的改變，進(jìn)而影響細(xì)菌表面毒力因子的展示。在產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(Listeriamonocytogenes)中，胞壁質(zhì)水解酶ispC基因的缺失可降低毒力因子ActA和InlC的表面展示，從而降低細(xì)菌對(duì)小鼠的致病力[19]。另外，有研究表明細(xì)菌鏈的增長(zhǎng)可以降低細(xì)菌的抗吞噬能力從而降低細(xì)菌毒力。例如，在肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)中，長(zhǎng)鏈狀的肽聚糖水解酶缺失株ΔlytA更容易被補(bǔ)體系統(tǒng)識(shí)別，從而導(dǎo)致其更容易被中性粒細(xì)胞捕獲[20]。

綜上，本研究鑒定了一種新的無乳鏈球菌N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NalA，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探索該蛋白結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。