歐陽文凱，盛敏，蔡帥，李躍忠，李國軍，鄧家國，謝小國，萬里平，李剛

（常德云港生物科技有限公司，湖南常德 415001）

甾體化合物又稱類固醇化合物，是環(huán)戊烷多氫菲類化合物的總稱，普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)[1]。甾體母核包含3個(gè)六元環(huán)和1個(gè)五元環(huán)，結(jié)構(gòu)式見圖1。不同的甾體化合物的區(qū)別主要在于其C17位置上的取代基團(tuán)不同以及甾體母核上雙鍵位置的不同[2]。本研究所用原料豬去氧膽酸（HDCA）和豬膽酸（HCA）屬于2種不同的甾體化合物，結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖1 甾體母核

圖2 豬去氧膽酸（a）和豬膽酸（b）結(jié)構(gòu)

甾體類化合物包括性激素類、固醇類、膽汁酸、維生素D、腎上腺素、強(qiáng)心苷元、抗生素和昆蟲蛻皮皮激素等。近年來，甾體類藥物逐步上升為僅次于抗生素的第二大藥物，具有很高的藥物價(jià)值[3]。

目前，甾體類藥物的合成方法主要分為化學(xué)方法和生物方法?；瘜W(xué)方法容易對(duì)環(huán)境造成污染，合成工藝復(fù)雜，且某些化合物通過化學(xué)方法難以合成，而生物轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少、對(duì)環(huán)境危害小等優(yōu)點(diǎn)，受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究[4]。微生物對(duì)甾體化合物的每個(gè)位置幾乎都能進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中幾種常見的反應(yīng)類型包括羥基化反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、氫化反應(yīng)以及環(huán)氧化反應(yīng)[5]。

羥基化反應(yīng)是指在有機(jī)物各個(gè)基團(tuán)上引入羥基的反應(yīng)。羥基化反應(yīng)是生物轉(zhuǎn)化過程中較為常見的一種反應(yīng)，早在1952年MURRAY等[6]就發(fā)現(xiàn)了黑根霉能高效轉(zhuǎn)化黃體酮為11α-羥基黃體酮；李宴清等[7]的研究表明，其篩選分離得到的一株斜臥青霉菌能將16,17α-環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化為7β-羥基-16α,17α-環(huán)氧黃體酮和7β,11α-雙羥基-16α,17α-環(huán)氧黃體酮兩種產(chǎn)物，其中7β-羥基-16α,17α-環(huán)氧黃體酮為底物在7號(hào)位引入一個(gè)羥基得來，7β,11α-雙羥基-16α,17α-環(huán)氧黃體酮為前者在11號(hào)位引入一個(gè)羥基得來。YE等人[8]的研究表明，他們分離出的一株真菌能將遠(yuǎn)華蟾蜍精12號(hào)位碳原子特異性羥基化，得到了6種羥基化后的產(chǎn)物。

脫氫反應(yīng)為氧化反應(yīng)的一種形式，是減少有機(jī)化合物中氫原子數(shù)目的過程。CATROUX等[9]在醋酸可的松的1,2位上引入雙鍵形成醋酸脫氫可的松，抗炎效果增加了4倍左右；SMITH等[10]的研究分離出了7株能使6號(hào)和7號(hào)位孕酮和雄烯二酮B環(huán)脫氫的真菌。

氫化反應(yīng)是指有機(jī)化合物和氫分子發(fā)生反應(yīng)。FARAMARZI等[11]在對(duì)菌株AcremoniumstrictumPTCC 5282生物轉(zhuǎn)化1,4-雄甾二烯-3,17-二酮（ADD）的過程中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵的第1天，ADD 17位碳原子上的酮基就被還原為羥基；PANG等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)Burkholderia cepaciaSE-1可將16α,17α-環(huán)氧孕烯醇酮加氫還原為20-羥基-16α,17α-環(huán)氧孕甾-4-烯-3-酮。

環(huán)氧化反應(yīng)是指在化合物雙鍵兩端碳原子間加上一原子氧形成三元環(huán)的氧化反應(yīng)。?Z?INAR等[13]對(duì)新魯斯可皂苷元進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究的過程中，發(fā)現(xiàn)尤里卡農(nóng)桿菌主要影響皂苷元B和C環(huán)上的氧化和環(huán)氧化反應(yīng)；ALFOOTY等人[14]的研究發(fā)現(xiàn)毛霉菌（Mucor plumbeus）能夠?qū)?7β-乙酸基-5α-雄甾-3-烯環(huán)氧化化為7β-乙酸基-3α,4α-環(huán)氧-5α-雄甾烷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基配方

篩選培養(yǎng)基：HDCA 0.3%（或HCA 0.3%）、硫酸銨0.1%、磷酸二氫鉀0.1%、磷酸氫二鉀0.1%、氯化鈉0.05%、硫酸鋅0.002%、硫酸亞鐵0.001%、無菌水，pH值7.5左右（加2%瓊脂即為固體培養(yǎng)基）。

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、無菌水，pH7.0。另加入瓊脂20 g/L即為LB固體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏1.5%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、葡萄糖1.0%、磷酸二氫鉀0.1%、甘油50.0%、無菌水，pH7.0。

1.1.2 試劑與儀器

硫酸銨、氯化鈉、硫酸鋅、硫酸亞鐵、丙三醇，AR級(jí)，湖南匯虹試劑有限公司；磷酸二氫鉀，AR級(jí)，廣東光華科技股份有限公司；磷酸氫二鉀，AR級(jí)，國藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨，BR級(jí)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖，AR級(jí)，西隴科學(xué)股份有限公司；革蘭氏染色試劑盒，杭州微生物有限公司；豬去氧膽酸（HDCA），常德云港生物科技有限公司；豬膽酸，四川廣漢市維康植化有限公司。

GL21M型高速冷凍離心機(jī)，常州金壇良友儀器有限公司；BXM-85VE型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；420-BS型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；THZ-300型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；P3100型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株的篩選

取樣：于常德云港生物科技有限公司車間門板、下水道、倉庫周圍泥土、倉庫后水溝、圍墻邊泥土等地點(diǎn)取樣，每個(gè)地點(diǎn)取樣5 g裝于10 mL離心管中，4 ℃冰箱保藏。

樣品處理及培養(yǎng)：每個(gè)樣品稱取1 g于新的10 mL離心管，加入5 mL無菌生理鹽水，充分振蕩混勻后靜置1 min，然后分別加0.1 mL上清至裝有10 mL液體篩選培養(yǎng)基的試管中，每個(gè)樣品接種2支試管，30 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，具體視生長情況而定。

分離純化：對(duì)試管初篩培養(yǎng)基中微生物進(jìn)行分離純化，每支試管用接種環(huán)挑取后劃線于固體篩選培養(yǎng)基中，每個(gè)單菌落用接種環(huán)挑取劃線分離，分離后的每個(gè)單菌落再經(jīng)過多次反復(fù)劃線進(jìn)行純化。

保藏：篩選得到可保存的單菌落時(shí)，短期保存可直接保存平板于4 ℃冰箱中，長期保存菌種選擇用甘油保存。將單菌落接種于保種液體培養(yǎng)基（即篩選培養(yǎng)基）中，30 ℃振蕩培養(yǎng)，待菌體生長起來后，與50%甘油1∶1混合，分裝至無菌EP管中，封口膜封口后凍存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 供試菌株的革蘭氏染色鏡檢及菌落形態(tài)觀察

將分離純化后的菌株接種于固體LB平板，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，用于觀察菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢，革蘭氏染色具體操作步驟參考杭州微生物有限公司革蘭氏染色試劑盒說明書。

1.2.3 供試菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵培養(yǎng)：取甘油管活化后的菌液0.5 mL接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，觀察生長情況結(jié)束發(fā)酵。

酶制備：發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)pH值，取樣鏡檢。將發(fā)酵液用超聲破碎儀破碎15～30 min，然后用30%硫酸銨進(jìn)行鹽析，溶解后離心，得到固體酶制劑。

轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：取0.5 g HCA（或0.5 g HDCA）于三角瓶，溶于100 mL水，加入酶制劑，調(diào)節(jié)至與發(fā)酵后pH值一致，30 ℃、160 r/min條件振蕩培養(yǎng)，每2 d取樣一次，進(jìn)行HPLC和TLC檢測(cè)，觀察底物變化情況。

1.2.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析、分離與鑒定

轉(zhuǎn)化后樣品進(jìn)行HPLC和TLC檢測(cè)，經(jīng)HPLC和TLC檢測(cè)確認(rèn)有新物質(zhì)產(chǎn)生后送至中山大學(xué)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

（1）薄層色譜（TLC）法分析。取10μL處理好的樣品點(diǎn)樣于已活化好的GF254硅膠板。展層劑為二氯甲烷∶石油醚∶乙酸乙酯=7∶2∶1，展層完成后，用10%磷鉬酸乙醇溶液均勻噴灑至硅膠板上，置于80℃烘箱里干燥30 min，化合物顯藍(lán)色，不同產(chǎn)物位置不同。HCA和HDCA標(biāo)準(zhǔn)品處理方法與上述一致。

（2）高效液相（HPLC）法分析。用流動(dòng)相（色譜純甲醇∶0.1%磷酸溶液=90∶10）復(fù)溶后用0.22 μm的有機(jī)膜過濾除雜。HPLC分析條件如表1所示。

表1 HPLC分析條件

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

菌株SX-1菌落形態(tài)如圖3（a）所示，菌落為較小的淡黃色圓形菌落，表面光滑，易挑取。菌株SX-1革蘭氏染色結(jié)果如圖3（b）所示，菌株SX-1被染色顏色為紫色，是一株革蘭氏陽性菌，細(xì)菌形態(tài)為圓球狀。研究發(fā)現(xiàn)能轉(zhuǎn)化甾體化合物的微生物多為革蘭氏陽性細(xì)菌，如EYSSEN等人[15]的文獻(xiàn)報(bào)道的一篇關(guān)于HCA的生物轉(zhuǎn)化研究中，分離出的一株菌——HDCA-1，能轉(zhuǎn)化豬膽酸HCA為豬去氧膽酸HDCA。

圖3 菌株SX-1菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TLC分析

以HDCA或HCA為唯一碳源，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種菌株SX-1，進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，取48 h的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行TLC分析，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)以HDCA為底物時(shí)，發(fā)現(xiàn)HDCA并無明顯消耗，也沒有新的物質(zhì)產(chǎn)生，說明菌株SX-1對(duì)底物HDCA沒有明顯轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)以HCA為底物時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的HCA完全消失，而且有很明顯的新物質(zhì)產(chǎn)生，說明菌株SX-1對(duì)底物HCA有轉(zhuǎn)化作用。

圖4 菌株SX-1轉(zhuǎn)化HCA和HDCA的TLC結(jié)果分析

2.3 HCA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證TLC結(jié)果，對(duì)菌株SX-1轉(zhuǎn)化0 h、24 h和48 h的培養(yǎng)基進(jìn)行取樣和HPLC分析，結(jié)果如圖5～圖7所示。從圖5中可知，HCA的出峰時(shí)間約在9.437 min；如圖6所示，當(dāng)轉(zhuǎn)化時(shí)間為24 h時(shí)，有2種主要物質(zhì)能被檢測(cè)到，其中一個(gè)物質(zhì)的出峰時(shí)間是7.460 min，但只占總含量的4.2%，另一個(gè)物質(zhì)的出峰時(shí)間是9.392 min，與HCA的保留時(shí)間是一致的，占總含量的87.6%，說明只有少量的HCA被轉(zhuǎn)化；如圖7所示，當(dāng)轉(zhuǎn)化時(shí)間為48 h時(shí)，出峰時(shí)間在7 min的物質(zhì)為優(yōu)勢(shì)產(chǎn)物，總含量占到了85.2%，而HCA已經(jīng)完全被轉(zhuǎn)化。所以，根據(jù)TLC和HPLC分析，菌株SX-1對(duì)HCA有轉(zhuǎn)化作用，轉(zhuǎn)化效率較高且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物穩(wěn)定。

圖5 0.5%HCA的HPLC圖

圖6 菌株SX-1轉(zhuǎn)化HCA（24 h）HPLC圖

圖7 菌株SX-1轉(zhuǎn)化HCA（48 h）HPLC圖

2.4 HDCA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC分析

本研究同樣對(duì)HDCA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了HPLC分析，結(jié)果如圖8～圖10所示。從圖8可知，HDCA的出峰時(shí)間為12 min左右；從圖9和圖10中可知，菌株SX-1在0.5% HDCA存在的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h和48 h后，HPLC圖無明顯變化，12 min左右主峰未見消耗，也無其他時(shí)間優(yōu)勢(shì)峰產(chǎn)生。結(jié)合此前的TLC分析結(jié)果，可以判定菌株SX-1對(duì)底物HDCA沒有轉(zhuǎn)化作用。

圖8 0.5%HDCA HPLC圖

圖9 菌株SX-1轉(zhuǎn)化HDCA（24 h）HPLC圖

圖10 菌株SX-1轉(zhuǎn)化HDCA（48 h）HPLC圖

2.5 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

根據(jù)TLC分析和HPLC分析，菌株SX-1對(duì)HCA有明顯轉(zhuǎn)化作用，為進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，將樣品送至中山大學(xué)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為3,7-二酮基-6α-羥基-膽酸（圖11），對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要在3號(hào)位和7號(hào)位發(fā)生了脫氫反應(yīng)，使HCA的3號(hào)位和7號(hào)位羥基脫氫形成酮基。

圖11 豬膽酸及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

本文以豬去氧膽酸（HDCA）或豬膽酸（HCA）為底物，研究了菌株SX-1（革蘭氏陽性細(xì)菌）對(duì)其生物轉(zhuǎn)化作用。TLC和HPLC結(jié)果顯示，菌株SX-1對(duì)HDCA沒有明顯轉(zhuǎn)化作用，對(duì)HCA有轉(zhuǎn)化作用，48 h后HCA幾乎被完全轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為3,7-二酮基-6α-羥基-膽酸。SX-1是將HCA的3號(hào)位和7號(hào)位羥基轉(zhuǎn)化為酮基，可能與菌株SX-1分泌的脫氫酶有關(guān)。脫氫反應(yīng)為微生物轉(zhuǎn)化的主要類型，但國內(nèi)外文獻(xiàn)的報(bào)道大多關(guān)于C1和C2號(hào)位的脫氫，關(guān)于C3和C7號(hào)位脫氫的報(bào)道較少，這為后續(xù)研究方向提供了思路。