陳思琦，朱漪涵，義塘葦，曹國梅，代益，劉文權(quán)*

（1.江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗教研室，江西上饒 334000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，浙江溫州 325000）

近年來，隨著我國政府大力推進(jìn)宮頸癌的篩查工作，宮頸癌（HPV）疫苗的研發(fā)也取得了良好進(jìn)展，對宮頸癌的防治起到了積極作用[1]。但由于需要疫苗接種的人群多、范圍廣，人們對接種疫苗的認(rèn)知尚存在不足，加之進(jìn)口疫苗價格高等因素，接種疫苗效果仍不甚理想。目前臨床化療藥大部分為廣譜殺傷性藥物，多通過化學(xué)合成，缺乏對腫瘤治療的靶向性和特異性，且存在不同程度的藥物毒性[2]。因此，尋找一種更安全、高效且特異性靶向?qū)m頸癌的藥物是當(dāng)前宮頸癌防治研究的重要目標(biāo)之一。

凝集素（Lectin）屬于碳水化合物結(jié)合蛋白家族，廣泛存在于動植物和微生物中。凝集素對表面糖基化異常的多種腫瘤細(xì)胞均能產(chǎn)生細(xì)胞毒性或抑制生長，被認(rèn)為是一種新的腫瘤治療候選藥物，現(xiàn)已證實一些植物凝集素主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬途徑在體內(nèi)外表現(xiàn)出抗腫瘤活性[3]。

海藻凝集素（Griffithsin，GRFT）是從海洋紅藻（Griffithsiasp.）中提取的一種含121個氨基酸、分子量為13 kDa的凝集素[4]。本研究采用MTT法檢測重組海藻凝集素rGRFT對幾種腫瘤細(xì)胞株的潛在抗增殖活性。在測試的幾種癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)宮頸癌HeLa細(xì)胞對rGRFT的敏感性較高，并以此為模型進(jìn)一步探討了rGRFT抑制HeLa細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Hoechst 33258染料，美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、Dulbecco's Modified Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素，美國Gibco公司；Aelax-AnnexinV-PI試劑盒，美國invitrogen公司。

抗 caspase-3、caspase-8、bcl-2、bax、Bid 和β-actin的一抗，美國Cell Signaling公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，美國biosharp公司；純化的葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖，美國Sigma-Aldrich公司。

人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人包皮成纖維細(xì)胞（HFF）、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人胰腺癌PANC-1細(xì)胞、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

SmartSpec Plus型分光光度計，美國Biorad公司ChemiScope 6000增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光成像儀，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組GRFT二聚體的表達(dá)和純化

編碼GRFT二聚體的基因GRFT-linker-GRFT交由TAKARA公司合成，并將其克隆至pUC載體。該基因由兩個編碼GRFT的基因通過柔性氨基酸鏈GS linker（GGSGGGSGGGSG）連接從而保證兩個GRFT基因表達(dá)后可形成相互獨(dú)立的單體結(jié)構(gòu)。構(gòu)建重組質(zhì)粒pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT，轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)和測序鑒定后，將pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT/BL21在37 ℃下培養(yǎng)過夜，將菌液以1∶20的比例轉(zhuǎn)入5 mL Amp+LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，15 ℃誘導(dǎo)表達(dá)22 h。收集細(xì)菌，用超聲波粉碎離心后取上清的可溶性蛋白通過0.22 μm的細(xì)菌濾器，加入平衡好的鎳NTA瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱，用不同濃度的咪唑（10～500 mmol/L）洗脫液對重組GRFT蛋白進(jìn)行純化。最后采用透析法去除無機(jī)鹽離子，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HFF、MCF-7和HepG2細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HeLa和PANC-1細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。收集指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行增殖、凋亡、Western blot和PCR檢測。

1.2.3 細(xì)胞增殖試驗

采用MTT法檢測 rGRFT對 HeLa、PANC-1、HepG2、MCF-7和HFF細(xì)胞的影響。將細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板（5×104個/孔）中過夜培養(yǎng)12 h，細(xì)胞分別與 0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L和100 mmol/L的rGRFT共同孵育48 h，每孔加入25 μL的MTT試驗液（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后，取出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO。渦旋混合后孵育10 min，用分光光度計測定590 nm處的吸光度。所有的實驗都至少進(jìn)行3次。

抑制率按照式（1）進(jìn)行計算：

式（1）中：A0和A1分別為對照組和藥物處理組在590 nm處的吸光值。

1.2.4 單糖抑制實驗

將rGRFT與葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖三種單糖在37 ℃預(yù)孵育30 min，其他均與1.2.3方法相同。

1.2.5 Hoechst33258染色觀察腫瘤細(xì)胞凋亡

將HeLa細(xì)胞（5×104個/L）接種至鋪有蓋玻片的六孔板中培養(yǎng)過夜，次日加入IC50劑量的rGRFT孵育24 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入Hoechst33258染料避光孵育10 min，挑出蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞核的形態(tài)變化。

1.2.6 Annexin-V/PI雙染檢測腫瘤細(xì)胞早期凋亡

將HeLa細(xì)胞（5×105個/L）接種于60 mm培養(yǎng)皿中，加入50 μg/mL rGRFT處理24 h、48 h。處理后，將細(xì)胞消化洗滌離心（1 000 r/min，10 min）重懸于100 μL 1×AnnexinV緩沖液中，加入5 μL AnnexinV-488Aelax和1 μL PI，室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡細(xì)胞的百分比。

1.2.7 Western blot

將HeLa細(xì)胞（1.0×106個/L）接種于10 cm3的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，給予rGRFT處理。處理后的細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌，再懸浮在含有1%PMSF的RIPA緩沖液中，4 ℃作用30 min。裂解細(xì)胞在12 500×g，4 ℃下離心5 min，收集上清液蛋白，用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，15 V轉(zhuǎn)膜25 min后，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗分別用 Caspase3（1∶ 1 000）、Caspase8（1∶ 1 000）、Bax（1∶ 1 000）、Bcl-2（1∶ 1 000）、Bid（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次后分別用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗（1∶5 000）稀釋室溫孵育1 h，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光顯影。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)為至少3次獨(dú)立重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)，均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組數(shù)據(jù)之間比較采用Dunnett檢驗，對兩組數(shù)據(jù)之間比較采用ANOVA單因素方差分析，P＜0.05（*）和P＜0.01（**）分別表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)的顯著差異和極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 GRFT重組二聚體構(gòu)建及其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

重組質(zhì)粒pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT轉(zhuǎn)化至BL21細(xì)菌，加入IPTG誘導(dǎo)在15 ℃表達(dá)22 h，收集細(xì)菌后超聲裂解，將可溶性蛋白過Ni-NTA親和柱，目的蛋白主要在咪唑濃度為40～80 mmol/L時洗脫下來，Western blot分析結(jié)果表明，29 kDa處的二聚體條帶與14.5 kDa的兩個單一GRFT單位的結(jié)合大小是一致的（圖1a）。為了證實rGRFT二聚體與野生型蛋白具有相似的功能，用ELISA方法檢測了GRFT二聚體與HIV gp160的結(jié)合活性。與BSA的陰性對照相比，rGRFT能與gp160顯著結(jié)合（圖1b），這表明重組蛋白確為GRFT二聚體，并且與野生型蛋白具有幾乎相同的結(jié)構(gòu)和功能。

采用MTT法檢測GRFT對多種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，并以原代HFF細(xì)胞作為正常對照。實驗結(jié)果表明HeLa細(xì)胞對rGRFT更敏感，對MCF-7細(xì)胞和原代HFF細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒作用（圖1c）。

圖1 重組GRFT蛋白的表達(dá)及其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

因此，選擇HeLa細(xì)胞進(jìn)行下一步的研究，以劑量和時間依賴的方式用rGRFT處理HeLa細(xì)胞，MTT法檢測rGRFT對HeLa細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，rGRFT能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞死亡，尤其是隨著rGRFT濃度的升高（0～100 μg/mL），對HeLa細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用（圖1d），25 μg/mL GRFT作用24 h后，抑制率達(dá)50%以上。

通過單糖抑制實驗確定rGRFT的糖結(jié)合活性與其抗增殖活性之間的關(guān)系。采用不同濃度的rGRFT分別與葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡糖（NAG）預(yù)孵育30 min后再進(jìn)行增殖活性檢測。結(jié)果表明，單糖對rGRFT的抑癌作用沒有明顯的影響（圖1e）。提示rGRFT的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用與其糖結(jié)合活性之間沒有聯(lián)系。

2.2 rGRFT誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是臨床放射療法和化學(xué)療法抗腫瘤的一個重要靶點，凋亡過程可以消除過度產(chǎn)生、發(fā)育不正?；蚧驌p傷的細(xì)胞[5]。為驗證rGRFT誘導(dǎo)的自噬作用，通過Hoechst33258染色觀察凋亡腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)變化。在熒光顯微鏡下觀察到經(jīng)50 μg/mL rGRFT處理后，HeLa細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，如染色質(zhì)聚集、核碎裂及出現(xiàn)凋亡小體。而未處理組（0 h）仍為正常圓形、均勻染色的細(xì)胞核。然而，50 μg/mL rGRFT在24 h或48 h處理后沒有引起HFF細(xì)胞明顯的凋亡形態(tài)。提示rGRFT可選擇性地誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞晚期凋亡，但不能誘導(dǎo)非癌性HFF細(xì)胞凋亡。

用Annexin-V/PI雙染后，使用流式細(xì)胞儀檢測rGRFT誘導(dǎo)的早期凋亡細(xì)胞百分比，以區(qū)分活細(xì)胞（Annexin V2/PI2）、早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI2）、晚期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI+）和壞死細(xì)胞（Annexin V2/PI+）。PBS處理的HeLa細(xì)胞存活率為95.1%，隨著rGRFT加入濃度從25 μg/mL提高至50 μg/mL，細(xì)胞存活率從74.8%逐漸下降到43.5%，早期和晚期凋亡細(xì)胞比例從25%增加到53%。該結(jié)果MTT試驗一致，證實rGRFT蛋白能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞早期凋亡。

2.3 rGRFT激活HeLa細(xì)胞凋亡信號通路

采用50 μg/mL rGRFT處理24 h和48 h HeLa細(xì)胞，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Pro-caspase3、Caspase3、Pro-caspase8和Caspase8相對表達(dá)水平，探討rGRFT誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。結(jié)果表明，rGRFT激活HeLa細(xì)胞中的原天冬氨酸蛋白8（Pro-caspase8）和原半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Pro-caspase3），產(chǎn)生相應(yīng)的43 kDa和17 kDa的切割片段，在48 h時效果最顯著（圖2a）。

圖2 rGRFT激活HeLa細(xì)胞凋亡信號通路的檢測

此外，還發(fā)現(xiàn)50 μg/mL rGRFT能激活線粒體膜上的Bcl-2家族。結(jié)果表明，rGRFT可顯著提高HeLa細(xì)胞線粒體膜上促凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，Bax/Bcl-2比值與對照組（0 h）相比有顯著性差異（P＜0.05），均為Caspase和線粒體依賴性凋亡的特征，提示rGRFT通過線粒體途徑促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡（圖2b）。

2.4 rGRFT誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬的檢測

Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)rGRFT處理后，HeLa細(xì)胞中LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，與未處理對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3a）。免疫熒光分析顯示，rGRFT處理的HeLa細(xì)胞LC3呈聚集分布，而對照組呈彌漫分布，處理后24 h組熒光強(qiáng)度與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3b）。

圖3 rGRFT誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬的檢測

3 結(jié)論

許多報道表明，凝集素通過其碳水化合物結(jié)合能力誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。玉竹凝集素是從中草藥玉竹（Polygonatum odoratum）中提取的甘露糖結(jié)合凝集素（GNA）相關(guān)的凝集素家族。甘露糖α（1,3和1,6）可抑制甘露糖對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用[6]。相反，本研究表明，應(yīng)用半乳糖不能抑制rGRFT對腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用，rGRFT通過其他結(jié)構(gòu)域而不是其半乳糖結(jié)合域與腫瘤細(xì)胞相互作用。

本研究結(jié)果證實，與其他凝集素類似，GRFT通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活自噬信號通路在HeLa細(xì)胞中發(fā)揮其死亡誘導(dǎo)作用。隨著培養(yǎng)時間的延長，rGRFT處理的HeLa細(xì)胞早期和晚期凋亡細(xì)胞增加，而存活細(xì)胞下降。rGRFT處理導(dǎo)致Caspase3/9激活，細(xì)胞色素C釋放，線粒體膜電位降低，促凋亡的Bax和Bid上調(diào)，抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xl下調(diào)，PARP斷裂，這些都是Caspase和線粒體依賴性凋亡的特征。除凋亡外，rGRFT還誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬，表現(xiàn)為經(jīng)rGRFT作用后HeLa細(xì)胞LC3呈聚集分布，而對照組LC3呈彌散狀態(tài)，表明促進(jìn)LC3-I的表達(dá)和向LC3-II的轉(zhuǎn)化。

現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的許多植物凝集素雖然對癌癥細(xì)胞有一定的抑制效應(yīng)，但對正常細(xì)胞總是表現(xiàn)出不良的副作用。本研究發(fā)現(xiàn)rGRFT對HeLa細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性作用，同時不表現(xiàn)出人類T細(xì)胞有絲分裂活性，也不會誘導(dǎo)經(jīng)過處理的人類細(xì)胞系（如外周血單個核細(xì)胞（PBMC）和宮頸陰道細(xì)胞）產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[7]，安全性較高。因此，GRFT在安全性方面比其他植物凝集素更具吸引力，本研究結(jié)果將為開發(fā)GRFT類抗宮頸癌藥物以及預(yù)防HIV感染提供新的方向。