栗鳳娟，王軍軍，梅麗，韓瑋璐

（江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇徐州 221004）

一直以來，胰島素均是治療糖尿病的有效藥物[1-2]，但是普通胰島素存在作用時間短、吸收變異大、有明顯作用峰值及較高的低血糖發(fā)生率等諸多問題[3-4]，因此正逐漸被胰島素類似物替代[4]。門冬胰島素是一種胰島素類似物，用于治療糖尿病[5-8]，門冬胰島素30注射液是一種預混胰島素類似物，該藥物于2000年8月獲得歐洲藥物管理局（EMA）批準，2001年11月獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準，2003年3月獲得中國原食品藥品監(jiān)督管理局批準。門冬胰島素30注射液中30%為速效成分（門冬胰島素），70%為中效成分（魚精蛋白門冬胰島素），因此既可以提供速效胰島素成分用于降低餐后血糖，也可以提供中效胰島素成分用于降低空腹和基礎血糖。與精蛋白人胰島素注射液相比，門冬胰島素30注射液中速效部分具有起效時間更短，維持時間更短，即快速起效、快速回落的優(yōu)點，更加符合生理性胰島素分泌特征[9]。門冬胰島素30注射液作為通過口服降糖藥不能很好控制血糖的患者的胰島素起始治療方案，對餐后血糖水平改善更好，對血糖控制更全面，并且不會增加發(fā)生低血糖事件的風險。

門冬胰島素30注射液中的硫酸魚精蛋白是從魚類的精子或者成熟的睪丸細胞核中提取的聚陽離子抗菌短肽的硫酸鹽，它包括4種主要多肽[10]。魚精蛋白的含量和質量在很大程度上影響門冬胰島素30注射液的起效時間、峰值濃度及持續(xù)作用時間等[11]，因此需要建立一個操作簡便，且精密度和準確度均良好的方法來測定門冬胰島素30注射液中硫酸魚精蛋白的含量。SNYCERSKI等人報道可以使用HPLC法測定硫酸魚精蛋白含量，采用粒徑為10 μm的二氧化硅填充柱，流動相為0.15%三氟乙酸-乙腈（92∶8），pH值為2.5，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為214 nm，在15～100 μg/mL范圍內(nèi)，硫酸魚精蛋白峰面積與濃度呈線性關系（r=0.9926）[12]。但是在該色譜條件下，制劑中的胰島素和防腐劑等物質不能快速洗脫出來，因此不適用于門冬胰島素30注射液中硫酸魚精蛋白的檢測。HOFFMANN等人研究發(fā)現(xiàn)，使用C8色譜柱，以0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH值為2.0）∶乙腈（97.5∶2.5）為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，可以分離出硫酸魚精蛋白中4個主要多肽[13]，但是該方法中多肽峰的分離度及保留時間易受流動相中乙腈含量的影響，重復性差。

因此本文開發(fā)了一種適用于門冬胰島素30注射液中硫酸魚精蛋白的高效液相色譜檢測方法，旨在解決上述方法的弊端。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

乙腈，色譜純，Merck KGaA；二水合磷酸二氫鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸，質量分數(shù)≥85.0%，國藥集團化學試劑有限公司；硫酸魚精蛋白，1 kg/瓶，批號3JC0001，BioChem Corporation；試驗產(chǎn)品為門冬胰島素30注射液，3 mL：300單位，批號201903504，江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責任公司。

1.1.2 儀器

SPD-M20A高效液相色譜儀，日本島津公司；FE20酸度計、XS105分析天平，梅特勒國際貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH值為1.8）：取二水合磷酸氫二鈉20.7 g，加水900 mL溶解，用磷酸調pH至1.8，加水至1 000 mL，經(jīng)微孔濾膜（水系0.45 μm）過濾。

流動相A為0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH1.8），流動相B為0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH值為1.8）-乙腈（65∶35）。

色譜柱：Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：55 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；進樣器溫度：5 ℃；進樣量：100 μL。

按表1進行梯度洗脫，將4～15 min所有峰面積之和作為硫酸魚精蛋白的總峰面積，以外標法計算出硫酸魚精蛋白的含量。

表1 門冬胰島素30注射液硫酸魚精蛋白含量測定梯度洗脫表

1.2.2 對照溶液的制備

稱取硫酸魚精蛋白適量，精密稱定，用0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋并定量制成每毫升中含魚精蛋白0.32 mg的溶液，混勻，過濾即得對照品溶液。

1.2.3 空白溶液的制備

按門冬胰島素30注射液的處方配制不含硫酸魚精蛋白的溶液，每毫升溶液中加入9.6 mol/L的鹽酸溶液3 μL酸化，混勻后過濾即得空白溶液。

1.2.4 供試品溶液的制備

（1）標準曲線溶液：精密稱取硫酸魚精蛋白約140 mg，置于50 mL容量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸溶解，搖勻；依次稀釋，分別制成溶度為0.196 mg/mL、0.224 mg/mL、0.252 mg/mL、0.280 mg/mL、0.308 mg/mL、0.336 mg/mL和0.364 mg/mL的對照品溶液。

（2）穩(wěn)定性溶液：取門冬胰島素30注射液適量，每毫升中加入9.6 mol/L鹽酸3 μL酸化，混勻后過濾。分 別 于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h和48 h時進樣測定。

（3）重復性溶液：取門冬胰島素30注射液，每毫升中加入9.6 mol/L的鹽酸溶液3 μL酸化，混勻后過濾。平行處理6份。

（4）中間精密度溶液：取門冬胰島素30注射液，每毫升中加入9.6 mol/L鹽酸溶液3 μL酸化，用0.45 μm的濾膜過濾。兩名分析人員分別平行處理6份，分別記為中間精密度1～6和中間精密度7～12，并使用不同的儀器測定。

（5）準確度溶液：按照門冬胰島素30注射液處方量配制含魚精蛋白為80%、100%、120%處方量的3個濃度的制劑，分別平行3份，每個樣品運行2次。

2 結果與分析

2.1 專屬性

空白溶液、對照品溶液、供試品溶液圖譜分別見圖1、圖2、圖3。結果表明，硫酸魚精蛋白多肽峰（4～15 min）與門冬胰島素、苯酚峰及間甲酚峰（22～25 min）的分離度大于10，且硫酸魚精蛋白多肽峰出峰時間區(qū)域無其他峰干擾。

圖1 空白溶液圖譜

圖2 對照品溶液圖譜

圖3 供試品溶液圖譜

本文使用流動相A為磷酸鹽緩沖液（pH值為1.8），流動相B為磷酸鹽緩沖液（pH 1.8）-乙腈（65∶35），硫酸魚精蛋白多肽在前15 min通過低濃度的乙腈進行梯度洗脫時分離出來；門冬胰島素和防腐劑在流動相B的比例提高到100%時快速洗脫出來；然后流動相從30 min恢復到初始比例，并運行至60 min結束。按照洗脫順序，前4個洗脫峰Pro-1、Pro-2、Pro-3、Pro-4為硫酸魚精蛋白的4個主要的多肽，代表了硫酸魚精蛋白的主要成分[14]。以4～15 min洗脫出來的所有作為硫酸魚精蛋白的總峰面積，按外標法計算硫酸魚精蛋白含量[15]。

2.2 線性與范圍

門冬胰島素30注射液硫酸魚精蛋白含量測定線性結果見表2，以硫酸魚精蛋白的峰面積（A）對濃度（C）進行線性回歸，線性回歸方程為A=1 654.9C+4.4146，相關系數(shù)r=0.9999，線性關系良好。

表2 門冬胰島素30注射液硫酸魚精蛋白含量測定線性結果

2.3 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性溶液硫酸魚精蛋白峰面積RSD（n=9）為0.81%，表明供試品溶液至少在48 h內(nèi)穩(wěn)定，見表3。

表3 門冬胰島素30注射液硫酸魚精蛋白含量穩(wěn)定性測定結果

2.4 重復性

重復性溶液的RSD（n=6）為0.43%，表明該方法重復性良好，見表4。

表4 門冬胰島素30注射液硫酸魚精蛋白含量測定重復性結果

2.5 中間精密度

中間精密度溶液的RSD（n=12）為0.41%，表明該方法中間精密度良好，見表5。

表5 門冬胰島素30注射液硫酸魚精蛋白含量測定中間精密度結果

2.6 準確度

80%、100%、120%濃度的平均回收率為100.32%，RSD為0.78%（n=9），表明回收率良好，見表6。

表6 門冬胰島素30注射液硫酸魚精蛋白含量測定回收率結果

3 結論

本文建立了門冬胰島素30注射液中硫酸魚精蛋白的測定方法，該方法以0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH1.8）為流動相A，0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH1.8）-乙腈（65∶35）為流動相B，色譜柱為Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為55 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長214 nm；進樣量為100 μL。此法可以快速、簡便、準確地測定門冬胰島素30注射液中硫酸魚精蛋白的含量。