尹京偉，寧周神，巢志英，金志興，董偉

（江西理工大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，江西贛州 341000）

稀土素有“工業(yè)黃金”的美譽，被廣泛應(yīng)用于智能陶瓷、軍事設(shè)備等領(lǐng)域[1]，可以提升金屬材料的性能以及農(nóng)作物的產(chǎn)量等。隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展及社會的不斷進步，全球?qū)ο⊥恋男枨罅坎粩嗵嵘Ｎ覈鳛橄⊥临Y源大國，對稀土的開采規(guī)模不斷擴大，盡管隨著經(jīng)驗的積累和科技的進步，采用的多種工藝流程和提取方法有了一定的提升，但依舊存在缺陷。而稀土的大量開采導(dǎo)致的土壤及地下水的污染[2-3]、山體滑坡、土壤酸化、植物破壞和生活環(huán)境的破壞[3]等問題也日益嚴(yán)峻。

前期研究表明，芽孢桿菌等菌株具有根際促生及稀土離子吸附等功能，在微生物修復(fù)污染礦山土壤中發(fā)揮重要作用[4-5]。本文對實驗室保藏的枯草芽孢桿菌菌株進行稀土離子脅迫耐受性研究，以期搞清枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特性，為其在離子型稀土礦山土壤修復(fù)的實踐應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

枯草芽孢桿菌菌種由美國微生物科學(xué)院院士Peter Setlow（美國康涅狄格大學(xué)醫(yī)學(xué)院，UConn Health）提供，在本實驗室保藏。

1.2 試劑與儀器

氯化鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硝酸鋱六水化合物，分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；2,6-吡啶二羧酸，分析純，上海九鼎化學(xué)科技有限公司；HEPES，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

YXQ-75SII型滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV755B型紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；SuPerMax300型多功能酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司；NCY-E200型相差顯微鏡，尼康儀器（上海）有限公司；JY92-IIN型超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；3H16RI型智能高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；HZQ-F400型立體式震蕩培養(yǎng)箱，常州智博瑞儀器制造有限公司；TOMG-10C型微電腦生化培養(yǎng)箱，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 培養(yǎng)基配方

LB液體培養(yǎng)基（1 L）：10 g氯化鈉、10 g蛋白胨、5 g酵母浸粉，調(diào)pH至7.0左右。LB固體培養(yǎng)基額外添加18～20 g瓊脂。

2×SG固體培養(yǎng)基配方：970 mL去離子水中加入營養(yǎng)肉湯16 g，1 mol/L MgSO4溶液2 mL，2 mol/L氯 化 鉀 溶 液 13 mL，1 mol/L MnCl2溶 液 100 μL，0.036 mol/L FeSO4溶液 30 μL，瓊脂粉 15 g，定容到1 L，高壓滅菌，滅菌后加入單獨滅菌的20 mL 50×硝酸鈣·葡萄糖溶液。

1.4 芽孢的制備

1.4.1 菌種活化與培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)過夜后得到活化菌株。活化好的菌種接入LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、250 r/min培養(yǎng)5 h得到菌液。取100 μL上述菌液于2×SG固體培養(yǎng)基中進行涂布，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.4.2 芽孢制備

將培養(yǎng)基上的菌體收集至離心管，于4 ℃、8 000r/min離心10 min后除去雜質(zhì)，用無菌水懸浮菌液，超聲破碎6 min后離心除去細胞破碎物，反復(fù)多次，直至相差顯微鏡下觀察到95%的菌體為明亮菌體，說明芽孢純化完成。將制備好的芽孢放入4 ℃冰箱保存。

1.5 芽孢萌發(fā)測定

1.5.1 芽孢液體培養(yǎng)基萌發(fā)

取兩EP管中的芽孢于15 mL離心管中，取一定量稀釋一定倍數(shù)（設(shè)為X），測定溶液在600 nm處吸光度A（0.3～0.8），得到芽孢母液的OD濃度A0=A×X。

LB液體培養(yǎng)基中加入離心后的芽孢稀釋液，于37 ℃、200 r/min下測定600 nm下未加芽孢和加芽孢后培養(yǎng)基吸光度，每5 min測量并記錄1次數(shù)據(jù)。

以硝酸鋱六水合物為原料制備10 mmol/L的Tb3+母液，配制不同濃度Tb3+（0 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L和1 000 μmol/L）的LB液體培養(yǎng)基的各50 mL，高壓蒸汽滅菌后待用。

取OD值接近0.8的芽孢稀釋液，離心后加入溶液中，每隔5 min測定并記錄加入芽孢后培養(yǎng)基在600 nm下的吸光度。

1.5.2 芽孢萌發(fā)劑激活萌發(fā)

通過稀釋一定倍數(shù)（X）后測得OD600A1為0.3～0.8，計算出芽孢母液的OD600A=X×A1，將芽孢母液稀釋[(X×A1)/2]倍后得到OD600為2的芽孢母液。向酶標(biāo)板孔中依次加入20 μL HEPES緩沖液和無菌水（作為補充），再各加100 μL OD600為2.0的芽孢母液，然后添加不同量的Tb3+母液（10 mmol/L），最后再各加入20 μL的纈氨酸（0.1 g/L）。在熒光激發(fā)波長為275 nm，發(fā)射波長為545 nm下每隔2 min測定酶標(biāo)板內(nèi)混合溶液的熒光強度[6]。

1.6 芽孢桿菌的耐脅迫實驗

1.6.1 芽孢桿菌母液

對活化的菌種進行擴大培養(yǎng)：用LB液體培養(yǎng)基在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)12 h后獲得枯草芽孢桿菌母液[8]。

1.6.2 加入菌后測定

制備含有不同濃度的Tb3（+0 μmol/L、600 μmol/L、1 200 μmol/L、1 800 μmol/L 和 2 400 μmol/L）的培養(yǎng)基各50 mL。在上述培養(yǎng)基中加1 mL芽孢桿菌母液，在37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)。每隔1 h對加入菌液前后的培養(yǎng)基進行OD600連續(xù)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋱離子對芽孢萌發(fā)及生長的影響

芽孢在含不同濃度鋱離子的LB培養(yǎng)液中的萌發(fā)情況如圖1、圖2所示。結(jié)果表明，LB能夠刺激芽孢萌發(fā)，當(dāng)培養(yǎng)30～40 min后芽孢OD值降至原來的50%左右，此時芽孢全部萌發(fā)（相差顯微鏡下觀察，芽孢已由明亮變?yōu)榛液冢?。之后的時間OD值慢慢升高，芽孢經(jīng)歷長出過程，直至形成細胞，并進行繁殖。

圖1 枯草芽孢桿菌芽孢在LB培養(yǎng)液中的萌發(fā)曲線

圖2 不同濃度鋱離子對枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)影響

如圖2所示，在低濃度的鋱離子溶液中芽孢萌發(fā)基本相似，以0 μmol/L的Tb3+的實驗為對照，可以看到1 000 μmol/L Tb3+會抑制芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)，且抑制強度隨著Tb3+濃度的升高而增強。上述結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)受稀土離子的濃度影響較小，對稀土離子耐受性較強，離子型稀土礦山廢水中的稀土離子濃度對于芽孢來說還在耐受范圍之內(nèi)。然而，濃度過高的Tb3+會抑制芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)，抑制效果的強弱可以通過600 nm下達到最低吸光度的時間不同來表現(xiàn)（OD600的拐點表示芽孢全部萌發(fā)的時間點），時間越長則該濃度Tb3+的抑制效果越強，反之則抑制效果越弱。

2.2 芽孢萌發(fā)劑激活的萌發(fā)動力學(xué)

如圖3所示，以纈氨酸為萌發(fā)劑，通過添加不同劑量的鋱離子研究它對芽孢萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，高濃度Tb3+抑制芽孢萌發(fā)，熒光強度的高低與結(jié)合物的量在一定范圍內(nèi)成正比。添加500 μmol/L鋱離子測得的熒光強度比1 000 μmol/L的高，說明高于500 μmol/L的Tb3+會抑制芽孢的萌發(fā)。而比較500 μmol/L與200 μmol/L的Tb3+添加量發(fā)現(xiàn)，在200 μmol/L下Tb3+濃度未達到飽和，Tb3+飽和濃度應(yīng)在200～1 000 μmol/L。

圖3 鋱離子對纈氨酸激活的芽孢萌發(fā)動力學(xué)影響

2.3 芽孢桿菌對鋱離子的耐受性

不同鋱離子濃度對枯草芽孢桿菌細胞生長的影響如圖4所示。結(jié)果表明，在一定Tb3+濃度范圍內(nèi)，Tb3+的濃度越高對枯草芽孢桿菌的抑制作用越強?？莶菅挎邨U菌的半致死Tb3+濃度大于2 400 μmol/L。

圖4 鋱離子對枯草芽孢桿菌細胞生長的影響

Tb3+濃度在500～1 000 μmol/L時，對枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)及該菌的生長都有抑制作用，且濃度越高抑制作用越強。本研究結(jié)果與前期研究一致，即Tb3+濃度對芽孢桿菌芽孢萌發(fā)、細胞生長都有影響[9-11]。

3 結(jié)論

本文研究了稀土離子鋱對枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)、生長的影響，發(fā)現(xiàn)存在低濃度促進、高濃度抑制的現(xiàn)象。而對于離子型稀土礦山廢水中的Tb3+來說，實際濃度遠低于本實驗用的抑制濃度，很可能對枯草芽孢桿菌的芽孢萌發(fā)以及生長有促進或者只有較弱的抑制效果。

因此，未來的研究方向主要為：（1）微生物與植物的聯(lián)合修復(fù)研究，特別是根際促生菌的篩選利用以及利用轉(zhuǎn)基因、基因編輯技術(shù)定向改造微生物以適用于治理離子型稀土礦山；（2）利用多種微生物聯(lián)合吸附與回收稀土離子，從而減少稀土離子的流失和對礦山生態(tài)環(huán)境的破壞，實現(xiàn)離子型稀土資源綠色開發(fā)與應(yīng)用。