劉張淮，吳 霆，王家軍，朱春艷，張熒熒，孟慶國(guó)

( 1.寶應(yīng)縣水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 揚(yáng)州 225800； 2.南京師范大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省水生甲殼動(dòng)物病害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023 )

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱螯蝦、龍蝦、淡水小龍蝦，屬甲殼綱、十足目、螯蝦科、原螯蝦屬，主要分布于我國(guó)江蘇、浙江、安徽、湖北、湖南等十余個(gè)省市地區(qū)，現(xiàn)已成為我國(guó)養(yǎng)殖范圍最廣的淡水螯蝦品種[1]。然而隨著我國(guó)克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖業(yè)興起，相關(guān)病害的發(fā)生也越來(lái)越普遍，主要包括真菌性、細(xì)菌性、病毒性和寄生蟲類疾病。已報(bào)道的克氏原螯蝦常見(jiàn)病原主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[2]、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[3-4]、擬態(tài)弧菌(V.mimicus)[5]、螺原體(Spiroplasma)[6-7]和白斑綜合征病毒[8]等。

克氏原螯蝦爛尾病是一種細(xì)菌性疾病，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中也時(shí)有發(fā)生，主要病因是由于機(jī)械損傷、互相打斗殘食或被幾丁質(zhì)分解類細(xì)菌感染引起，但病原菌種類未有定論。在爛尾病發(fā)病早期，患病蝦出現(xiàn)尾扇邊緣發(fā)紅、水泡、潰爛、壞死等癥狀，高溫季節(jié)嚴(yán)重感染時(shí)可引起病蝦整個(gè)尾部潰爛甚至死亡?？耸显r細(xì)菌性疾病的病原菌種類繁多，其相關(guān)研究也十分廣泛，但關(guān)于早春季節(jié)克氏原螯蝦爛尾病的病原研究鮮有報(bào)道。2020年4月，江蘇省揚(yáng)州市某養(yǎng)殖場(chǎng)克氏原螯蝦出現(xiàn)爛尾癥狀，病蝦尾扇部位出現(xiàn)肉質(zhì)腫脹和灼燒狀疤痕，病蝦正常攝食，除尾扇邊緣潰爛外，體表和內(nèi)臟均無(wú)明顯病變，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察和PCR檢測(cè)排除真菌、寄生蟲和病毒病原。為防止該病原繼續(xù)發(fā)展產(chǎn)生更大危害，筆者采集病蝦樣本并開(kāi)展相關(guān)研究，為克氏原螯蝦疾病預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病克氏原螯蝦取自江蘇省揚(yáng)州市某養(yǎng)殖場(chǎng)，共計(jì)4尾鮮活病蝦，平均體質(zhì)量約20 g。健康克氏原螯蝦購(gòu)自揚(yáng)州市寶應(yīng)縣某養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體質(zhì)量(20±1) g。

1.2 試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于南京便診生物技術(shù)有限公司；TaKaRa MiniBEST通用基因組DNA提取試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)于Solarbio公司；動(dòng)物用藥敏分析試劑板購(gòu)于南京菲恩醫(yī)療科技有限公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR引物也由該公司合成。

1.3 細(xì)菌分離

取活體病蝦4尾，用無(wú)菌接種針蘸取尾部病灶組織于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取優(yōu)勢(shì)菌落于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上多次分離純化，得到2株代表菌株。同時(shí)將單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中增菌24 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 感染試驗(yàn)

將健康克氏原螯蝦分成2個(gè)試驗(yàn)組，分別感染2株分離菌。每個(gè)試驗(yàn)組分設(shè)5個(gè)小組，包括3個(gè)感染組和2個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行投放8尾蝦。3個(gè)感染組分別加入1×107、1×108、1×109cfu/mL密度菌懸液各5 mL，并使用無(wú)菌剪刀剪除部分尾扇；對(duì)照組1加菌液不剪尾扇，菌液密度1×109cfu/mL，對(duì)照組2不加菌液剪尾扇。試驗(yàn)中正常投喂飼料，每個(gè)養(yǎng)殖桶加水20 L，日換水1/4，試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)發(fā)病蝦尾扇感染部位進(jìn)行細(xì)菌再分離。

1.5 細(xì)菌鑒定

1.5.1 細(xì)菌形態(tài)和生理生化特性

觀察培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)，并對(duì)純化培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行革蘭氏染色，置于1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。同時(shí)測(cè)定病原菌蔗糖、半乳糖、尿素、精氨酸、賴氨酸等生理生化指標(biāo)。

1.5.2 16S rRNA和gyrB基因測(cè)序分析

取純化培養(yǎng)的新鮮菌液，按照試劑盒操作說(shuō)明分別提取2種細(xì)菌的DNA，用細(xì)菌通用引物序列F：5′-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3′和R：5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′[9]對(duì)菌株16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；gyrB基因引物序列為F：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGN GGNAARTTYGA-3′和R：5′-AGCAGGGTACG GATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTC AT-3′[10]。反應(yīng)體系(25 μL)：上下游引物各0.1 μL，模板2 μL，預(yù)混液12.5 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。16S rRNA和gyrB基因擴(kuò)增產(chǎn)物一部分進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，另一部分送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5.3 構(gòu)建gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹

將分離菌的gyrB基因序列提交BLAST檢索系統(tǒng)比對(duì)，選擇相似度較高的菌株基因序列，使用MEGA 7軟件鄰接法構(gòu)建gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(自展1000次)。

1.6 細(xì)菌相關(guān)特性分析

1.6.1 定居因子CFA基因檢測(cè)

DNA提取方法相同，定居因子CFA基因引物序列為F：5′-TCCAGCGCATTCA-3′和R：5′-TC CAGCCTTCGGCAAACG-3′[11]，退火溫度60.5 ℃，反應(yīng)體系和條件參照1.5.2中16S rRNA和gyrB基因擴(kuò)增。

1.6.2 幾丁質(zhì)酶chi基因檢測(cè)

DNA提取方法相同，幾丁質(zhì)酶chi基因引物序列為F：5′-CCAGGCGCCGTGGARRTCRTANSW CA-3′和R：5′-CGTGGACATCGACTGGGARTW YCC-3′[12]，退火溫度63 ℃，反應(yīng)體系和條件參照1.5.2。

1.6.3 藥物敏感性檢測(cè)

試驗(yàn)使用藥敏分析試劑板，對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素和甲砜霉素等8種常見(jiàn)抗菌藥進(jìn)行藥物敏感性分析，篩選有效抗菌藥物。參照微量二倍稀釋法測(cè)定藥物最低抑菌質(zhì)量濃度，藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離

自患病克氏原螯蝦病灶部位(圖1a)分離出2株具有不同形狀和色澤的代表菌株，分別編號(hào)為L(zhǎng)W2047-1和LW2047-2。

圖1 病蝦及死亡蝦癥狀Fig.1 Symptoms of diseased and dead red swamp crayfisha.采集病樣病灶部位; b.感染組蝦尾灼燒狀疤痕; c.感染組蝦尾潰爛; d.感染組蝦尾肉質(zhì)囊腫; e.對(duì)照組1蝦尾灼燒狀疤痕; f.高密度組死亡蝦癥狀; 箭頭表示病灶.a.infection focus of the diseased crayfish sample collected; b.cauterization scar on crayfish tail in infected group; c.rotted part on crayfish tail in infected group; d.fleshy cyst on crayfish tail in infected group; e.cauterization scar on crayfish tail in control group; f.symptoms of dead crayfish in high density group; Arrow shows infection focus.

2.2 人工感染試驗(yàn)

2.2.1 人工感染發(fā)病情況

人工感染后飼養(yǎng)10 d，菌株LW2047-1的感染組和對(duì)照組均無(wú)爛尾癥狀，高密度感染組出現(xiàn)少量死亡，死亡個(gè)體無(wú)爛尾癥狀。菌株LW2047-2各密度感染組均出現(xiàn)爛尾癥狀，平均發(fā)病率分別為70.8%、54.2%和45.8%，對(duì)照組1的平均發(fā)病率為25%，對(duì)照組2未出現(xiàn)爛尾癥狀(表1)。

表1 人工感染試驗(yàn)的發(fā)病情況Tab.1 Morbidity in artificial infection test

2.2.2 病蝦及死亡蝦癥狀

在飼養(yǎng)過(guò)程中，菌株LW2047-2感染組病蝦癥狀與采集的病蝦樣癥狀相似，病蝦可以正常攝食，早期尾扇剪切部位出現(xiàn)潰爛和肉質(zhì)囊腫，后期結(jié)痂形成灼燒狀疤痕(圖1b～d)。在未剪切尾扇的對(duì)照組1中同樣有小部分蝦產(chǎn)生尾部潰爛癥狀，癥狀相對(duì)較輕(圖1e)。在高密度組中有多尾蝦嚴(yán)重感染后死亡，在死亡蝦尾扇、肝胰腺、鰓和肌肉等組織中均能分離出該種細(xì)菌，死亡個(gè)體肝胰腺顏色正常，但有蛻殼未遂癥狀(圖1f)。感染試驗(yàn)結(jié)束后，從感染組病蝦尾部再次分離到與菌株LW2047-2特征相同的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，克氏原螯蝦爛尾病病原為菌株LW2047-2。

2.3 細(xì)菌鑒定

2.3.1 菌落及細(xì)菌形態(tài)

分離菌株LW2047-2的菌落為圓形，乳白色，邊緣薄，直徑為1～2 mm，油亮反光(圖2a)。該菌為革蘭氏陰性菌，短桿狀，兩邊鈍圓，分散排列，偶爾出現(xiàn)菌體黏結(jié)成長(zhǎng)條狀，以單個(gè)菌體或多個(gè)菌體聚集成團(tuán)居多(圖2b)。

圖2 菌株LW2047-2的菌落和細(xì)菌形態(tài)Fig. 2 Colony and bacterial morphology of strain LW2047-2a.菌落形態(tài); b.細(xì)菌形態(tài)(1000×).a.colony morphology; b.bacterial morphology (1000×).

2.3.2 生理生化特性

生化鑒定結(jié)果顯示，菌株LW2047-2各項(xiàng)理化指標(biāo)符合檸檬酸桿菌(Citrobacter)特性。與《水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué)》[14]相關(guān)數(shù)據(jù)相比，除部分測(cè)定項(xiàng)目無(wú)數(shù)據(jù)外，其余結(jié)果均一致(表2)。

表2 菌株LW2047-2的生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain LW2047-2

2.3.3 16S rRNA基因序列分析

菌株LW2047-2的16S rRNA基因經(jīng)測(cè)序后，得到長(zhǎng)度為495 bp的有效序列，將基因序列提交BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，該菌株16S rRNA基因與弗氏檸檬酸桿菌I-M-5-3、CX-100和78B-3相似性最高，達(dá)到99.35%，但與檸檬酸桿菌屬其他幾種菌株的相似性也較高(>98.91%)(表3)。

表3 菌株LW2047-2的16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果Tab.3 Result of 16S rRNA gene sequence alignment of LW2047-2

2.3.4 gyrB基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

菌株LW2047-2的gyrB基因經(jīng)測(cè)序后，得到長(zhǎng)度為1144 bp的有效序列。選擇嗜水氣單胞菌作為外群模式菌，構(gòu)建gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，菌株LW2047-2與一株弗氏檸檬酸桿菌歸為一支。

圖3 gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of gyrB gene

2.4 細(xì)菌相關(guān)特性分析

2.4.1 定居因子CFA基因檢測(cè)

CFA基因引物擴(kuò)增出約100 bp的清晰條帶，陰性對(duì)照為無(wú)菌水(圖4a)。檢測(cè)結(jié)果表明，弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2具有定居因子基因CFA，可以表達(dá)產(chǎn)生毒力因子黏附素。

2.4.2 幾丁質(zhì)酶chi基因檢測(cè)

chi基因引物擴(kuò)增出的條帶大小約為250 bp，引物特異性好，無(wú)雜帶，條帶大小與目的片段一致，陰性對(duì)照為無(wú)菌水(圖4b)。檢測(cè)結(jié)果表明，弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2具有幾丁質(zhì)酶基因chi，可以表達(dá)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

圖4 CFA基因和chi基因序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of CFA gene and chi genea.CFA基因擴(kuò)增; b.chi基因擴(kuò)增; M.DL2000 DNA Maker; 1.弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2擴(kuò)增產(chǎn)物; 2.無(wú)菌水.a.Amplification of CFA gene; b.Amplification of chi gene; M.DL2000 DNA Maker; 1.PCR product of C. freundii LW2047-2; 2.Sterile water

2.4.3 藥物敏感性檢測(cè)

利用藥敏分析試劑板測(cè)定弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2的藥物敏感性(表4)。結(jié)果表明，該菌株對(duì)恩諾沙星和硫酸新霉素高度敏感，對(duì)磺胺類藥物不敏感，對(duì)氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素中度敏感。

表4 弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2的藥物敏感性Tab.4 Antimicrobial sensitivity of C. freundii LW2047-2

3 討 論

3.1 弗氏檸檬酸桿菌的免疫學(xué)特性

弗氏檸檬酸桿菌屬腸桿菌科，菌體呈桿狀，半透明或不透明，表面有光澤，邊緣不整齊，不產(chǎn)生吲哚，是一種革蘭氏陰性、氧化酶陰性的發(fā)酵產(chǎn)氣桿菌。該菌為條件致病菌，需氧或兼性厭氧，在光學(xué)顯微鏡下多為單個(gè)或雙個(gè)散狀排列，電鏡下可見(jiàn)其鞭毛，無(wú)芽孢和莢膜[14-15]。弗氏檸檬酸桿菌作為一種水產(chǎn)動(dòng)物常見(jiàn)病原菌廣泛存在于自然環(huán)境中，如土壤、水、污水及食物等，是一種監(jiān)測(cè)水體污染的重要細(xì)菌學(xué)指標(biāo)[16]。本試驗(yàn)表明，克氏原螯蝦爛尾病病原為弗氏檸檬酸桿菌，關(guān)于該菌的研究較為常見(jiàn)，但鮮見(jiàn)其引發(fā)克氏原螯蝦爛尾病的報(bào)道。

弗氏檸檬酸桿菌的毒力因子主要包括溶血素、內(nèi)毒素、蛋白水解酶、幾丁質(zhì)酶和黏附素[12,17-18]。筆者針對(duì)克氏原螯蝦作為甲殼動(dòng)物具有幾丁質(zhì)外殼的特征，結(jié)合該細(xì)菌感染尾扇后固定繁殖的特點(diǎn)，選取幾丁質(zhì)酶和黏附素兩種毒力因子做深入研究。黏附素又稱定居因子，Minkara等[19]研究發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌可通過(guò)尿素酶分解尿素，在腸道黏膜表面附著固定以對(duì)抗惡劣的外界環(huán)境，尿素酶便是一種重要的黏附素；肖寧等[18]檢測(cè)了一株克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌的細(xì)胞黏附性，發(fā)現(xiàn)該菌可黏附于鯉(Cyprinuscarpio)上皮瘤細(xì)胞(EPC)周圍，并逐漸產(chǎn)生致病性，最終使細(xì)胞死亡；閻斌倫等[20]對(duì)三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)源弗氏檸檬酸桿菌的定居因子抗原基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌具有定居因子抗原CFA基因。本試驗(yàn)中，同樣擴(kuò)增出弗氏檸檬酸桿菌LW-2047-2的CFA基因，片段大小約100 bp，證明該菌株很可能具有黏附在受損組織或細(xì)胞周圍的特性，能在傷口處固定繁殖，形成囊腫或潰爛。除了黏附素，另一種毒力因子為幾丁質(zhì)酶，關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌分泌幾丁質(zhì)酶的研究報(bào)道較少，Xu等[12]自大黃魚(Larimichthyscrocea)腸道中分離出一株可分解幾丁質(zhì)的弗氏檸檬酸桿菌，并克隆了該菌的幾丁質(zhì)酶chi-X基因，最終在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)蛋白可分解膠體幾丁質(zhì)。本試驗(yàn)中，同樣在弗氏檸檬酸桿菌LW2047-2中檢測(cè)出幾丁質(zhì)酶chi基因，證明弗氏檸檬酸桿菌能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，腐蝕克氏原螯蝦幾丁質(zhì)外殼。在人工感染試驗(yàn)中，對(duì)照組中尾扇完整的蝦同樣發(fā)生輕度尾扇潰爛，這可能與該菌分泌幾丁質(zhì)酶的特性有關(guān)。

3.2 弗氏檸檬酸桿菌的致病性

弗氏檸檬酸桿菌作為人類腸道中的正常菌群，是一種兼性厭氧的條件致病菌。Barnes等[21]最早于1946年報(bào)道該菌與人的腹瀉有關(guān)。近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，由弗氏檸檬酸桿菌引起的水生動(dòng)物病害報(bào)道越來(lái)越多。如2012年，弗氏檸檬酸桿菌引起安徽省全椒縣兩家稻田養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的克氏原螯蝦暴發(fā)性死亡[22]；2016年，柳州市柳城縣一家養(yǎng)殖場(chǎng)羅非魚大量死亡，經(jīng)鑒定后確定病原菌為弗氏檸檬酸桿菌[23]；同樣在2016年，安徽省當(dāng)涂縣河道攔網(wǎng)養(yǎng)殖克氏原螯蝦大量發(fā)病死亡，病原菌為弗氏檸檬酸桿菌[18]。

弗氏檸檬酸桿菌作為魚類病原菌最早被報(bào)道于1982年，Sato等[24]研究發(fā)現(xiàn)，該菌為日本水族箱中翻車鲀(Molamola)的病原菌，病魚表現(xiàn)出體表出血、腐爛，并伴有脾臟紅腫、肝臟色淡和腸炎等癥狀；Sanz等[25-26]分別報(bào)道該菌與虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的病害有關(guān)，可引起魚體體表潰爛、肝臟發(fā)白和脾臟發(fā)黑等癥狀，同時(shí)影響腸胃系統(tǒng)。弗氏檸檬酸桿菌作為甲殼動(dòng)物病原菌也有報(bào)道，肖寧等[18]從患病克氏原螯蝦肝胰腺中分離出一株弗氏檸檬酸桿菌，該菌引起克氏原螯蝦肌肉腫脹，同時(shí)導(dǎo)致心臟出現(xiàn)色素沉著，肝胰腺顏色變深；沈錦玉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌可引起紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)死亡，死蝦尾部腫脹，并結(jié)有疤痕，這與本試驗(yàn)中克氏原螯蝦爛尾癥狀十分相似；閻斌倫等[20]自病死三疣梭子蟹體內(nèi)分離出一株弗氏檸檬酸桿菌，該菌可引起蟹體肌肉糜爛、肝胰腺和肌肉組織水腫；黃曉東等[28]通過(guò)回感試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)弗氏檸檬酸桿菌會(huì)引起中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)黑鰓和肝胰腺呈淺黃色癥狀。克氏原螯蝦具有與上述甲殼動(dòng)物相似的生理結(jié)構(gòu)和相近的種屬關(guān)系，但與上述研究結(jié)果不同的是，在本次人工感染試驗(yàn)中，高密度組病死蝦的肝胰腺并未出現(xiàn)褪色或顏色加深，說(shuō)明在早春季節(jié)，水溫較低、溶解氧條件較好時(shí)，該菌致病性較弱，主要影響甲殼受損的蝦，造成體表潰爛等癥狀，后期致病性可能受環(huán)境和溫度影響增強(qiáng)，引起蝦體內(nèi)臟病變和死亡。此外，弗氏檸檬酸桿菌還可侵染蛙、鱉和貝類等[29-31]多種水生動(dòng)物。

3.3 弗氏檸檬酸桿菌的藥物敏感性

在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，抗菌藥物可直接殺滅細(xì)菌，達(dá)到防病治病的效果，而不同細(xì)菌的藥物敏感度各不相同。因此，分析病原菌的藥物敏感性對(duì)疾病防控和養(yǎng)殖生產(chǎn)指導(dǎo)具有重要意義。陳紅蓮等[22]檢測(cè)出克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌對(duì)7種喹諾酮類、5種氨基糖苷類藥物和頭孢他啶敏感，對(duì)5種抗菌藥物具有耐藥性；沈錦玉等[27]分離出的紅螯螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌L1和L2對(duì)復(fù)方新諾明、丁胺卡那等7種抗菌藥物敏感；林啟存等[30]從中華鱉(Trionyxsinensis)中分離出的弗氏檸檬酸桿菌對(duì)復(fù)方新諾明和四環(huán)素耐藥，對(duì)慶大霉素、左旋氧氟沙星和丁胺卡那霉素等藥物敏感；萬(wàn)彪等[32]從甌江彩鯉(Cyprinuscarpiovar.color)中分離的弗氏檸檬酸桿菌GZMT2013-CF對(duì)恩諾沙星、頭孢噻呋和慶大霉素等7種抗生素高度敏感，對(duì)磺胺類藥物具有抗性。本試驗(yàn)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，弗氏檸檬酸桿菌LW-2047-2對(duì)恩諾沙星和硫酸新霉素敏感，這與黃曉東等[28]藥敏試驗(yàn)結(jié)果相似，生產(chǎn)中可使用恩諾沙星和硫酸新霉素等藥物來(lái)減少此類疾病的發(fā)生。另一方面，弗氏檸檬酸桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)產(chǎn)生不同程度的耐藥性，養(yǎng)殖戶需靈活使用不同抗菌藥物，相關(guān)研發(fā)部門也應(yīng)盡快研發(fā)如中草藥免疫制劑和可抑制病原菌毒力基因表達(dá)或阻斷毒素傳遞的新型藥物。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，引發(fā)克氏原螯蝦爛尾病的病原為弗氏檸檬酸桿菌。該菌具有較強(qiáng)的致病性，不僅會(huì)侵蝕克氏原螯蝦的幾丁質(zhì)外殼，造成尾部組織紅腫、潰爛，嚴(yán)重感染時(shí)還可能直接引起病蝦死亡。在養(yǎng)殖過(guò)程中，尤其需要注意弗氏檸檬酸桿菌在早春季節(jié)的潛在危害，提前做好防范措施，秉承“預(yù)防為主，防重于治”的疾病防治理念。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中可使用恩諾沙星和硫酸新霉素進(jìn)行防治。