張宇洋，董建宇，孫 昕，張秀梅

( 1.中國海洋大學，海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003； 2.浙江海洋大學 水產(chǎn)學院，浙江 舟山 316022； 3.青島海洋科學與技術(試點)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266072 )

食物網(wǎng)及其動態(tài)變化研究有助于理解群落生態(tài)學和生態(tài)系統(tǒng)的功能機制，而運用準確的技術手段來確定消費者的生態(tài)位寬度和食物組成對該領域研究至關重要[1]。目前關于食性分析方法主要分為3類：傳統(tǒng)方法(直接觀察、消化道內(nèi)容物分析和顯微鏡鏡檢等)、生化方法(脂肪酸組成分析和穩(wěn)定同位素分析等)和分子方法(同工酶電泳、單克隆抗體與多克隆抗體的免疫組化分析和DNA分子技術等)。3類食性分析方法針對不同的研究對象和研究范圍各有其優(yōu)缺點[2-4]。傳統(tǒng)方法操作靈活、無硬性設備要求、直觀快捷，但存在人為鑒定誤差、辨識度低、耗時耗力等缺點；生化分析方法測定步驟簡單，適用范圍廣，不足之處是難以確定食物組成，同一類群特征值存在偏差；早期關于野生動物食性的分子分析方法，通常采用的是同工酶電泳和單克隆抗體檢測。同工酶電泳方法廉價、易操作，但靈敏度和特異性低[5]。單克隆抗體靈敏度和特異性高，但特異性抗體的制作是一個困難且耗時的過程[6]。此外，上述這兩種方法僅能檢驗一對物種的營養(yǎng)關系，且往往需要先驗知識，難以研究食物網(wǎng)中消費者的完整食譜[7]。

20世紀90年代，隨著分子生物學的發(fā)展，遺傳信息載體DNA開始應用于食性分析中的獵物鑒定[8]?；贒NA的食性分析方法分為兩種：PCR鑒定和基于序列的鑒定。PCR鑒定是通過擴增獵物特定長度的DNA片段，使用電泳技術將其分離和可視化以實現(xiàn)獵物鑒定的一種分析方法。1992年H?ss等[9]首次將PCR鑒定技術運用于棕熊的食性研究。隨后，Asahida等[10]使用該方法發(fā)現(xiàn)了砂蝦(Crangonaffinis)可捕食石鰈 (Kareiusbicoloratus) 幼體；Agusti等[11]在小盲蝽(Dicyphustamaninii)腸道內(nèi)容物中檢測到了獵物棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)的DNA。至此，基于PCR鑒定的食性研究方法初露鋒芒，逐漸成為21世紀初期最常用的獵物鑒定技術[12]?；谛蛄械墨C物鑒定技術本質(zhì)上是DNA條形碼技術，這是一種基于自然界生物基因序列唯一性原理，通過一段或者幾段特異性基因序列實現(xiàn)物種的快速準確鑒定的技術方法[13]。到2003年，DNA條形碼技術迎來發(fā)展的黃金期[14]，其簡便、高效、準確的檢測方法，使其成為生命科學領域發(fā)展最快的前沿技術之一[15]。近年來，隨著分子生物學數(shù)據(jù)庫的完善和高通量測序技術(二代測序技術，NGS)的出現(xiàn)，整合了DNA條形碼理念和二代測序技術的DNA宏條形碼技術應運而生。宏條形碼技術不受獵物種類限制，可以在分類學物種水平上識別獵物，尤其適合研究難以觀測或者有特殊習性的廣食性動物的食物譜[16]，且允許對大量樣本進行并行處理和測序[17]。鑒于DNA物種鑒定技術的巨大應用潛力，基于DNA測序的食性分析研究領域正經(jīng)歷著大規(guī)模流行的熱潮[18]，已逐漸成為分子攝食生態(tài)學研究的主流方法。而國內(nèi)基于DNA分子生物學的食性研究起步相對較晚，尚未引起足夠的重視，文獻多為該領域研究方法可行性的討論，多聚焦于食性定性分析研究[19]，研究內(nèi)容多為獵物種類鑒定研究與方法可行性探索[19]。但隨著測序成本的降低與生物信息分析方法的日漸成熟，基于DNA分子生物學的食性研究技術引發(fā)了國內(nèi)諸多學者的關注，近期涌現(xiàn)了多篇相關文獻[20-23]。為了促進國內(nèi)DNA物種鑒定技術在攝食生態(tài)學中的應用，筆者采用文獻計量法，對基于DNA分子生物學食性分析的相關文獻進行定量與定性的可視化分析。旨在直觀、清晰地剖析該領域的發(fā)展脈絡、研究趨勢和研究熱點等，以期為未來基于DNA的食性分析研究提供借鑒和啟示。

1 分析方法與數(shù)據(jù)來源

本研究的數(shù)據(jù)來源于Web of Science(WOS)核心合集，通過編寫檢索式來限定檢索范圍。根據(jù)相關論文中的“條形碼”、“獵物鑒定”和“分子鑒定”3個常用主題詞的英文書寫，編制檢索式：TS=[(*barcod* OR “prey identification” OR “molecular dietary analysis ” OR “prey DNA”) AND (diet* OR “predator-prey” OR “trophic ecology” OR “feeding ecology”)]，檢索時間為2020年1月19日，共檢索到716篇文獻。

CiteSpace是美國德雷塞爾大學陳超美教授開發(fā)的，用來呈現(xiàn)學科知識結構、規(guī)律和分布狀況的引文可視化分析軟件[24]。HistCite是Thomson Reuters 公司開發(fā)的，一款用來繪制引文關系圖譜，定位領域重要文獻的引文編年可視化分析軟件[25]。利用WOS數(shù)據(jù)庫檢索得到的數(shù)據(jù)，進行文獻計量學分析。使用WOS的“分析檢索結果”功能初步分析文獻，利用HistCite軟件檢索學科基礎知識文獻，探究學科發(fā)展歷史。在前兩者的基礎上，使用CiteSpace 5.6.R2軟件對文獻數(shù)據(jù)進行可視化分析，運用關鍵詞共現(xiàn)知識圖譜聚類分析和突現(xiàn)詞檢驗，體現(xiàn)該領域的研究熱點和研究趨勢。通過科研合作網(wǎng)絡，從作者、機構和國家3種層次分析該領域研究的相互合作關系。

2 研究結果分析

2.1 發(fā)文與引文量分析

WOS自帶的“分析檢索功能和引文報告功能”分析顯示，1997—2019年，該領域共發(fā)表文獻716篇，共被引頻次17 864次，去除自引后的引用頻次為13 373次，每篇平均引用次數(shù)24.88，H指數(shù)(H-index)為65。文獻數(shù)量隨時間的變化能夠反映該領域的發(fā)展趨勢，1996—2019年間，關于DNA分子生物學的食性研究發(fā)文量呈現(xiàn)緩慢增長—平穩(wěn)增長—快速增長3個階段(圖1)。分析發(fā)現(xiàn)1996—2004年關于該領域的年平均發(fā)文數(shù)量在3篇以下，研究處于探索階段；2005—2013年間不斷摸索改進了基于DNA的食性分析方法，發(fā)文量呈現(xiàn)平穩(wěn)增長，研究處于發(fā)展階段；2014—2019年由于研究方法的革新與條形碼數(shù)據(jù)庫的完善，該領域研究的關注度迅速上升。在眾多學者的不斷摸索下提出了相應的技術路線和優(yōu)化措施，形成了一套系統(tǒng)的基于DNA手段的食性分析方法，涌現(xiàn)出大量食性分析相關的研究文獻，從而推動該領域研究進入到快速發(fā)展階段。雖然基于DNA的分子生物學食性分析研究體系日漸成熟，但是目前整體刊文量仍較少，研究前景廣闊。

圖1 1997—2019年年度發(fā)表論文數(shù)量Fig.1 Annual number of publications from 1997 to 2019

2.2 發(fā)文期刊排名

WOS的檢索文獻期刊統(tǒng)計顯示，發(fā)文量排名前10的期刊共發(fā)文277篇(表1)，占總發(fā)文量的38.85%。其中，《PLoS ONE》刊文量最多為58篇，《Molecular Ecology》次之，然后是《Molecular Ecology Resources》和《Ecology and Evolution》。總體而言，Wiley旗下的分子生態(tài)學旗艦期刊《Molecular Ecology》和《Molecular Ecology Resources》是該領域發(fā)文量和影響力較高的核心期刊。此外，由于基于DNA的分子生物學食性分析技術具有綜合性和學科交叉的特點，刊文期刊廣泛涉及分子生態(tài)學、保護生態(tài)學、漁業(yè)、昆蟲學、海洋和淡水生物學、生物技術與應用微生物學等相關學科。

表1 發(fā)文量前10位的期刊Tab.1 Top ten journals in the number of published articles from 1997 to 2019

2.3 基于HistCite的學科基礎知識分析

使用HisCite軟件，對WOS檢索所得數(shù)據(jù)集進行的本地引用得分(LCS)分析。LCS即某一文獻在本地數(shù)據(jù)集中的被引用次數(shù)。由于WOS檢索數(shù)據(jù)與檢索詞有直接關系，可以認定基于WOS檢索的文章多為同一領域，基于LCS的引文關系文獻分析可以得到該研究領域內(nèi)的重要文獻或開創(chuàng)性文章(表2)。

表2 基于LCS分析前10位關鍵文獻Tab.2 Top ten key literatures based on LCS analysis

根據(jù)時間線分析，Symondson[7]2002年在《Molecular Ecology》上刊文詳細闡述了一系列分子生物學食性分析技術的研究背景，并比較了各自技術的優(yōu)劣，指出基于DNA檢測的獵物鑒定技術的高效性和通用性，其很有可能會取代其他分子生物學分析技術，該報道對DNA食性分析方法產(chǎn)生了巨大的推動作用。2005年Deagle等[30]利用克隆文庫和定量PCR (qPCR)方法檢測了圈養(yǎng)海獅 (Eumetopiasjubatus) 糞便中不同魚種的比例，結果顯示，從糞便DNA樣本中檢測到的魚種比例與已知投喂的魚種比例吻合，證實了基于DNA的食性分析方法能夠進行定量分析。盡管當時該方法在攝食生態(tài)學領域開展了一系列應用實踐，但尚未形成具體的試驗操作流程與規(guī)范指南。King等[26]2008年在《Molecular Ecology》上刊文，總結了DNA食性分析技術的主要流程和最佳實踐指南，成為引領該領域發(fā)展的標志性文獻。隨著高通量測序技術的興起，Deagle等[28]應用宏條形碼技術分析了澳大利亞3個不同繁殖區(qū)域內(nèi)海豹(Arctocephaluspusillusdoriferus)的食性，提出該技術極大地加強了研究食物網(wǎng)的能力，適用于對各種動物類群進行大規(guī)模食性分析研究，這也是宏條形碼技術第一次應用于大規(guī)模野生動物食物網(wǎng)研究。隨后，Deagle等[29]運用DNA宏條形碼技術分析了企鵝(Eudyptulaminor)的食性，并采用人工飼喂對比，著重強調(diào)了基于高通量測序的食性分析可以用于半定量食性分析。2009年，Valentini等[27]設計了能夠擴增植物葉綠體tRNA(trnL)區(qū)域的通用引物，這是首次將宏條形碼技術運用于植食性動物的食性研究，使得植食性動物的食物組成和資源分配研究成為可能。Valentini等[15]2010年在頂級期刊《Trends in Ecology & Evolution》上提出，在高通量測序技術支持下，DNA條形碼能為生態(tài)學家提供更加便捷、高效的研究方法，由此推動了DNA宏條形碼技術的興起。2011年，Zeale等[31]在原有COⅠ通用引物基礎上設計了長度157 bp適用于節(jié)肢動物的通用引物，該通用引物被證實可以準確識別被3種蝙蝠攝食的節(jié)肢動物類群。由于該引物的高效性和特異性，使之成為檢驗節(jié)肢動物(被捕食者)的常用通用引物[33]。2012年，法國學者Pompanon等[16]在《Molecular Ecology》發(fā)文，回顧了DNA食性分析技術的研究歷程，總結了宏條形碼食性分析方法的優(yōu)缺點，并指出受污染物擴增、PCR錯配等問題的限制，即便一個精心設計的研究也可能只提供一個物種飲食的半定量數(shù)據(jù)，強調(diào)了該領域相關研究需要重視數(shù)據(jù)的處理與分析。這篇文章也成為LCS最高的論文，其為后續(xù)研究提供了重要的指導經(jīng)驗[34]。Piol等[32]2015年也對定量分析提出了質(zhì)疑，認為使用COⅠ通用引物和阻斷引物(與宿主DNA目的基因片段結合阻礙其擴增的特異性引物)時，宏條形碼技術的定量分析能力有限，僅定性結果可靠，為后續(xù)研究提供了警示[35]。

綜合分析，LCS高的文章可被認為是與該領域發(fā)展歷史、技術創(chuàng)新息息相關的學科基礎文獻。它們通常為高被引文獻，研究內(nèi)容更加側重于對基于DNA食性分析技術的優(yōu)化和對該領域研究進程的總結。特別是前3篇論文(表2)貫穿該學科的發(fā)展，從基于PCR診斷的食性分析方法的出現(xiàn)，到采用DNA條形碼和DNA宏條形碼技術研究物種食性，詳細地闡述了該學科研究進程中相關分析理念和應用技術的革新。

2.4 研究熱點與趨勢

對標題或摘要、關鍵詞的提取能夠提煉文章研究的主要內(nèi)容。筆者依據(jù)關鍵詞共現(xiàn)知識圖譜聚類分析，通過主題詞頻揭示了該領域的研究趨勢(圖2)。通過共詞分析和突現(xiàn)檢測，分析了該領域的研究熱點(表3)。筆者將數(shù)據(jù)導入CiteSpace 5.6.R2中，時間切片為1 a，節(jié)點類型為關鍵詞，其余采用默認設置。其中模塊值(Q值)和平均輪廓值(S值)表征網(wǎng)絡結構與聚類清晰度。Q>0.3意味著網(wǎng)絡結構顯著，S>0.7意味著聚類高效令人信服[24]。關鍵詞突現(xiàn)強度越高代表該詞匯在某時間段內(nèi)的關注度越高；同質(zhì)性為衡量聚類成員相似程度，數(shù)值越趨近于1，相似性越高。

圖2 關鍵詞聚類知識圖譜Fig.2 Keyword clustering knowledge map

表3 突現(xiàn)詞檢測檢索表Tab.3 The table of burst words

關鍵詞聚類分析結果顯示，Q值為0.7675，S值為0.3934，表明關鍵詞共現(xiàn)圖譜構建合理。由于聚類的關鍵詞是依照頻率統(tǒng)計，聚類標簽中的奶牛、通緣步甲蟲(Pterostichusmelanarius)、湯氏紡錘水蚤(Acartiatonsa)和頭足類是研究的熱門物種，與研究前沿、研究趨勢無關，故舍棄。筆者依據(jù)聚類分析結果，選取前10聚類，繪制了基于DNA食性分析研究的共詞聚類分析的延伸內(nèi)容(表4)，同質(zhì)性均超過0.8，表明聚類相似程度較高。按照時間線分布：

表4 關鍵詞聚類主要信息Tab.4 The main information of keywords clustering

(1) 探索階段(1996—2004年)：伴隨著分子生物學技術的革新，DNA食性分析手段由于其便捷、高效的特性引發(fā)了生態(tài)學研究的重視。食性、單克隆抗體是該階段頻次最高的詞匯，表明基于免疫學的食性研究方法依然占據(jù)主流。但該階段研究熱點(表3)除單克隆抗體外還有聚合酶鏈反應。該階段基于DNA食性分析方法為PCR鑒定，且往往結合腸道內(nèi)容物分析、胃含物分析等手段[36-37]。其中COⅠ(線粒體DNA)為物種鑒定常用選擇區(qū)域，食性分析多應用于海洋廣食性物種營養(yǎng)關系的確認，如頭足類、灰突吻鱈(Coryphaenoidescinereus)等。

(2)發(fā)展階段(2005—2013)：該階段基于DNA食性分析手段日趨完善，涌現(xiàn)了大量的高頻詞匯和突現(xiàn)詞匯，表明基于DNA食性分析方法成為當時的研究熱點。DNA條形碼概念的提出使得獵物可以通過其DNA的特異性序列實現(xiàn)DNA物種鑒定。PCR、獵物DNA、DNA條形碼為該階段高頻詞匯，意味著PCR鑒定技術依然是該階段的核心研究內(nèi)容[26]。但自Hebert等[14]2003年提出DNA條形碼理念后，條形碼技術開始興起，基于DNA食性分析手段逐漸開始由PCR鑒定向條形碼技術過渡。聚類“NGS”表明高通量技術的出現(xiàn)，宏條形碼技術開始應用于廣食性物種食性多樣性分析。該階段的熱點研究內(nèi)容為獵物—捕食者關系和食物網(wǎng)，研究側重于為生物防治和生物保護等應用領域服務[38]。此外PCR、線粒體DNA、引物和測序等熱點研究內(nèi)容表明，引物選擇、PCR體系與循環(huán)條件、測序方法、目的基因的選擇、基因區(qū)域的選擇等諸多因素制約著DNA食性分析方法的使用，聚類“Primer”表明該階段圍繞引物展開了一系列研究。簡言之，PCR鑒定技術依然是該階段的熱點研究內(nèi)容，但基于測序技術的食性分析開始展露鋒芒。DNA食性分析方法的研究對象由捕食者和被捕食者相互作用拓展到了食物網(wǎng)的動態(tài)研究，從個體食性擴展到了種群規(guī)模的食性研究，并開始將其應用于更實際的生物防治和保護生物學等領域。

(3)高速發(fā)展階段(2014—2019)：DNA宏條形碼為該階段的高頻詞匯，基于DNA食性分析方法由PCR鑒定技術向DNA宏條形碼技術過渡。該技術可以通過計算測序產(chǎn)生序列的種類數(shù)與數(shù)據(jù)庫比對實現(xiàn)食物組成的定性研究，還可以比較不同獵物序列的相對豐度，來定量分析食物網(wǎng)內(nèi)的種間關系[1,33]，實現(xiàn)食性研究的半定量分析。由表4可見，研究趨勢為植食性有蹄類物種(瘤胃)食性研究[39]。隨著宏條形碼技術日漸成熟化和系統(tǒng)化[40]，并通過與其他研究方法的交叉融合，使得研究層次更加深入。例如，基于DNA的物種多樣性調(diào)查也依賴DNA宏條形碼技術，宏條形碼技術的應用能夠從分子角度分析群落多樣性和物種食性，可以準確分析食物選擇性，揭示廣食性捕食者復雜的攝食生態(tài)[41]。DNA宏條形碼技術與穩(wěn)定同位素食性分析方法(delta n-15)結合，可以探究食物網(wǎng)中不同物種的營養(yǎng)關系，完善食物網(wǎng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程[42]。目前，該領域的研究規(guī)模逐漸擴大，由種群生態(tài)學向保護生物學和群落生態(tài)學等研究方向拓展。

綜上，隨著DNA食性分析方法日趨完善，逐漸解決了全面分析食物網(wǎng)過程中面臨的技術難點，也使其成為分子生態(tài)學領域的一個十分活躍的方向。通過研究熱點和研究趨勢分析發(fā)現(xiàn)，各階段研究的規(guī)模逐步擴大，更加側重于在保護生物學領域的應用。研究方法逐漸由單克隆抗體、PCR凝膠電泳分析向DNA條形碼、DNA宏條形碼等技術過渡發(fā)展，研究方法不斷進步與完善，這均與分子生物學和測序技術的發(fā)展密切相關。目前，基于DNA宏條形碼技術的分子生態(tài)學食性分析是熱點研究內(nèi)容。

2.5 研究力量

CiteSpace提供了宏觀的國家或地區(qū)的合作網(wǎng)絡、中觀的機構合作網(wǎng)絡以及微觀的學者合作網(wǎng)絡分析。筆者使用CiteSpace繪制分子生物學食性分析研究的合作網(wǎng)絡知識圖譜，依次從國家、機構和作者3種層次評價了學術研究貢獻度。其中節(jié)點大小代表發(fā)文量的多少。筆者將數(shù)據(jù)導入CiteSpace 5.5.R2中，時間切片為2 a，節(jié)點類型依次為國家、機構和作者，國家合作網(wǎng)絡知識圖譜采用尋徑網(wǎng)絡法，網(wǎng)絡輔助裁剪策略采用合并網(wǎng)絡裁剪，其余圖譜采用默認設置。圖譜中節(jié)點用圓圈表示，連線粗細代表節(jié)點合作關系強弱。由3個指標衡量節(jié)點的重要性，即發(fā)文量、突發(fā)性、中介中心性。突發(fā)性高表明該節(jié)點某一時間段內(nèi)關注度高，中介中心性代表節(jié)點在該領域知識結構中關聯(lián)節(jié)點的重要性。

2.5.1 主要研究國家和地區(qū)

檢索發(fā)現(xiàn)有39個國家應用了DNA食性分析技術開展相關研究，其中美國的發(fā)文量居世界第一(222篇)，表明美國在分子生物學食性研究領域居于領導地位(表5)。然而，基于突現(xiàn)值和中介中心性的分析可知，相較于美國，英國和法國在該領域的研究具有更高的核心影響力。綜上，法國關于分子生物學的食性研究最為深入，綜合影響力較高，是該領域研究的核心國。而我國開始關注該領域的時間較晚，迄今，國際發(fā)文量居于第六位(41篇)。雖然科研水平和發(fā)文量在逐年上升，但目前我國在該領域研究的綜合影響力仍落后于歐美等發(fā)達國家(圖3)。

表5 合作發(fā)文量前10的國家Tab.5 Top ten countries in the number of cooperative papers

圖3 國家合作共現(xiàn)圖譜Fig.3 The network of country cooperation

2.5.2 主要合作研究機構

根據(jù)機構合作發(fā)文量來看(表6)，第一名為法國格勒諾布爾—阿爾卑斯大學(31篇)；英國卡迪夫大學位居第二位，發(fā)文量24篇；第三名澳大利亞南極分部和加拿大圭爾夫大學(22篇)。合作發(fā)文量居于前10的機構有半數(shù)在歐洲，2家在美洲，4家在澳大利亞。通過中介中心性比較和發(fā)文量比較，法國格勒諾布爾—阿爾卑斯大學、英國卡迪夫大學、丹麥哥本哈根大學在發(fā)文量和中介中心性上較高，說明這3家機構聯(lián)系緊密，在分子生物學的食性研究方面具有較高的學術影響力。而法國格勒諾布爾—阿爾卑斯大學突現(xiàn)值為9.23，表明該機構引領基于DNA分析食性研究的前沿，是該領域的核心研究機構。我國中科院有11篇，位居第14位，綜合影響力與西方發(fā)達國家尚有一定差距(圖4)。

表6 合作發(fā)文量前10的機構Tab.6 Top ten institutions in the number of cooperative papers

圖4 機構合作共現(xiàn)圖譜Fig.4 The network of institution cooperationUniv Tasmania.澳大利亞塔斯馬尼亞大學； Univ British Columbia.英屬哥倫比亞大學； Curtin Univ.澳大利亞科廷大學； Univ Turku.芬蘭圖爾庫大學； Australian Antarctic Div.澳大利亞南極分部； Univ Porto.葡萄牙波爾圖大學； Univ Helsinki.芬蘭赫爾辛基大學； Cardiff Univ.英國卡迪夫大學； Swedish Univ Agr Sci.瑞士農(nóng)業(yè)科技大學； Univ Bristol.英國布里斯托大學； Uniy Copenhagen.丹麥哥本哈根大學； Smithsonian Inst.美國史密森學會； Univ Innsbruck.澳大利亞因斯布魯克大學； INRA.法國農(nóng)業(yè)科學研究院； Univ Guelph.加拿大圭爾夫大學； Univ Oslo.挪威奧斯陸大學； Chinese Acad Sci.中國科學院； Univ Grenoble 1.法國格勒諾布爾—阿爾卑斯大學.

2.5.3 主要發(fā)文作者

作者的合作網(wǎng)絡知識圖譜可以深入分析挖掘?qū)W者間的合作關系，以及不同團隊間的團體效應。數(shù)據(jù)檢索發(fā)現(xiàn)，發(fā)文量最多的5位分別為法國學者Pierre Taberlet(24篇)、法國學者Eric Coissac(16篇)、澳大利亞學者Michael Traugott(15篇)、丹麥學者Thomas Gilbert(11篇)、英國學者Elizabeth L Clare(10篇)，該領域共有177名學者合作交流，且發(fā)文量均在2篇以上，說明該領域內(nèi)研究者相互引用、相互合作較為頻繁(表7)。學術團隊主要分為：Francois Pompanon、Alice Valentini、Pierre Taberlet和Eric Coissac等所在的法國格勒諾布爾—阿爾卑斯大學高地生態(tài)學實驗室，其研究聚焦于山地森林生態(tài)系統(tǒng)功能和生物多樣性，依靠長期的觀察和試驗，利用研究結果來模擬和預測生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)對全球變化的響應；Michael Traugott、Bettina Thalinger和Johannes Oehm等所在的澳大利亞因斯布魯克大學的生態(tài)學研究所，其主要研究是通過分子手段分析不同生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)間的相互作用，側重于研究農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)昆蟲與鳥類之間的相互作用[43-44]；Bruce E Deagle、Simon Neil Jarman(澳大利亞)等學術團隊主要應用分子生物學分析方法解析海洋生物的攝食生態(tài)[45-47]；Elizabeth L Clare(英國)、Eero Juhani Vesterinen(瑞典)、Aitor Arrizabalaga(西班牙)等學術團隊則是聚焦于農(nóng)業(yè)和森林生態(tài)中蝙蝠和蟲蛾之間的營養(yǎng)相互作用[48-50]。從作者合作圖譜(圖5)來看，大多數(shù)的學術合作來源于同一研究機構，但不同學術團隊間也存在著密切的聯(lián)系，該領域?qū)W術交流合作居多。

表7 合作發(fā)文量前5的作者Tab.7 Top five authors in the number of cooperative papers

圖5 作者合作共現(xiàn)圖譜Fig.5 The network of author cooperation

3 結語與展望

筆者利用WOS、HistCite和CiteSpace對基于分子生物學食性研究的相關文獻進行了定性、定量和可視化分析，厘清了該領域的發(fā)展脈絡、研究熱點、研究趨勢以及合作關系。通過發(fā)文量的年度波動分析發(fā)現(xiàn)，1996—2019年該領域歷經(jīng)了探索—發(fā)展—高速發(fā)展3個階段，近13年來，主要是研究技術和研究概念的革新，研究主題聚焦于捕食者—獵物營養(yǎng)關系的確定，向其他領域拓展較少。1996—2004年探索階段主要聚焦于基于DNA的獵物鑒定技術，PCR鑒定技術與腸道內(nèi)容物分析技術的結合分析。研究重心為優(yōu)化PCR擴增環(huán)節(jié)，如合適的目的基因、循環(huán)條件以及引物選擇等；2005—2013年為發(fā)展階段，King等[26]2008年為該領域提供了合理的實踐指南，基于DNA分子生物學食性分析方法得到了規(guī)范，PCR鑒定技術依然為當時流行的食性分析方法。但自加拿大學者Hebert等[14]2003年提出DNA條形碼理念后，基于測序鑒定的DNA條形碼技術異軍突起，DNA食性分析方法的兩大主線PCR鑒定和測序分析開始齊驅(qū)并進發(fā)展；2014—2019年為高速發(fā)展階段，由于宏條形碼技術可以在分類學物種水平上識別獵物，且其允許對大量樣本進行并行處理和測序。鑒于上述潛力，食性分析方法開始由PCR鑒定技術逐漸過渡到宏條形碼技術。目前該領域發(fā)表論文的數(shù)量幾乎呈指數(shù)增長[40,51]，宏條形碼技術成為當下無可爭議的研究熱點。

從上述3個階段研究內(nèi)容的變化可以看出，該領域的發(fā)展與分子生物學技術和測序技術的進步密切相關。隨著基于DNA食性分析方法的規(guī)范化和體系化，研究方法不僅追求科學嚴謹?shù)脑囼炘O計和嚴格規(guī)范的試驗操作，還要求無偏見的、嚴謹?shù)纳镄畔W數(shù)據(jù)處理流程。研究內(nèi)容不再局限于食物組成，還涉及食性比較、攝食變化、食物選擇性、營養(yǎng)生態(tài)位劃分、食物網(wǎng)及其營養(yǎng)動力學等研究[52-55]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，研究人員開始用宏條形碼技術解決基于營養(yǎng)關系的生態(tài)問題，如恢復生態(tài)學、關鍵種識別、生態(tài)系統(tǒng)脆弱性評估和入侵物種響應等[38,56-58]。研究尺度由個體擴展到種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)等多個層次。

與各階段相對應，學科基礎知識分析的前3篇綜述(表2)分別對應各階段的研究熱點和研究問題，為本領域影響力最高的3篇文章，均不同程度地推動并引領了下一階段的發(fā)展，表現(xiàn)出緊密的傳承性。通過發(fā)文期刊排名和LCS排名也可以看出，《Molecular Ecology》和《Molecular Ecology Resources》是推動該領域發(fā)展的核心期刊，這兩個頂級期刊均隸屬于美國Wiley出版社，美國的科研力量全方位推動和引領了該領域的發(fā)展。在國家合作關系圖譜中也可以看出，分子生物學食性分析的研究力量主要分布于美國、法國和澳大利亞。但就研究機構而言，法國格勒諾布爾—阿爾卑斯大學的研究較為深入，合作較為頻繁，有極高的學術影響力。在分子生物學食性研究領域貢獻較高的作者有Pierre Taberlet(法國)、Eric coissac(法國)、Michael Traugott(澳大利亞)、Thomas Gilbert(丹麥)、Elizabeth Clare(英國)等。從合作圖譜的3個層面來看，中國與美國、法國等國家在該領域仍存在著較大差距，其主要原因在于我國分子攝食生態(tài)學研究起步較晚，主要聚焦于傳統(tǒng)的胃含物分析法，仍將分子生物學食性分析作為一種輔助手段，大規(guī)模實際應用欠缺[4]。因此使得我國該領域研究發(fā)文量較少，且多為定性分析或者與其他食性分析方法結合等[59-61]，缺少高被引和具有影響力的高水平論文。

DNA食性分析方法憑借其高效性和特異性，廣泛應用于生態(tài)學研究。但是每種DNA食性分析技術都有各自的優(yōu)缺點，并且適用性不一。如PCR診斷需要事先了解捕食者潛在獵物，據(jù)此設計特異性引物，而且處理大量樣品時耗時耗力[62]，但在定量分析方面優(yōu)于其他分析方法；基于初代測序的條形碼技術只能針對單個樣本，受限于工作量和測序成本，僅適用于獵物鑒定精確到種的小樣品量分析[63]；與前者相比，宏條形碼技術在研究食物多樣性和食譜范圍時更具優(yōu)勢，且靈敏度高，但易受污染，數(shù)據(jù)處理方法不夠完善[16]。除此之外，DNA食性分析方法還存在一些技術層面的問題，如引物選用組合、擴增效率差異、測序誤差、數(shù)據(jù)庫缺失等。但隨著技術的發(fā)展和完善，鳥槍法測序[64]、數(shù)字PCR[65]、三代測序技術[66]等無偏見精確定量技術的出現(xiàn)，以及數(shù)據(jù)庫的豐富[67]、分析方法的創(chuàng)新[68]、數(shù)據(jù)處理方法和軟件的更新迭代[69]，都為該領域研究提供了廣闊的發(fā)展平臺。從長遠看，基于DNA食性分析方法有廣闊的應用前景，可能會替代一些傳統(tǒng)分析技術。但目前該領域研究尚未成熟，不同研究方法的結合應用能夠取得更好的效果、解決更多復雜且富有研究意義的問題[2]。如DNA食性分析僅能反映短期攝食狀況，穩(wěn)定同位素能夠反映長期攝食狀況，兩者相輔相成，適用于復雜食物網(wǎng)及營養(yǎng)動力學研究[42]。隨著科學技術的發(fā)展和研究方法的交叉互補，DNA食性分析技術將得到更加寬泛、更加深入的應用。在未來，新定量方法開發(fā)、宏條形碼技術數(shù)據(jù)優(yōu)化、食物網(wǎng)營養(yǎng)動力學和生態(tài)系統(tǒng)功能研究將成為該領域的主流趨勢[18]。基于高通量測序的食性分析技術是當下的研究熱潮，鑒于其優(yōu)勢和潛力，很可能在未來數(shù)十年繼續(xù)保持這一迅猛的發(fā)展勢頭[40]。在生態(tài)學研究越來越傾向于多方位合作交流的今天，我國應當加強國際間的交流合作，培養(yǎng)核心團隊，加強實踐，完善操作體系和操作流程，進一步補充我國生物物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，擴大分子生物學食性分析研究的規(guī)模，提高食物網(wǎng)營養(yǎng)動力學和生態(tài)系統(tǒng)功能研究的層次和水平。