黃祖彬,梁齡月,李維昊,李 娜,丁 利,洪美玲
( 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南省熱帶動(dòng)植物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ???571158 )
龜鱉養(yǎng)殖在21世紀(jì)初發(fā)展迅猛,大型養(yǎng)殖戶及水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社等各種養(yǎng)殖模式在國內(nèi)快速發(fā)展,形成了多樣化、規(guī)?;?、數(shù)量集約化的產(chǎn)業(yè)模式[1]。中華草龜(Mauremysreevesii)與中華條頸龜(M.sinensis)是目前我國養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的經(jīng)濟(jì)龜類[2],據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前在我國人工養(yǎng)殖的中華條頸龜約有6000萬只,產(chǎn)量約3萬 t[2]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的增加、養(yǎng)殖環(huán)境污染的加重,環(huán)境脅迫對養(yǎng)殖龜鱉健康的危害加劇,這嚴(yán)重制約了龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中最主要的環(huán)境污染物之一,主要來源于未消耗的飼料、糞便等有機(jī)廢棄物的礦化過程[3-4]。氨氮在水體中通常以非離子氨(NH3)和離子氨(NH4+)的形式存在。非離子氨是氨氮毒性的主要來源,具有較高的脂溶性,極易穿透細(xì)胞膜,導(dǎo)致其在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)過度積累,使水產(chǎn)動(dòng)物出現(xiàn)生長減緩、免疫系統(tǒng)被抑制和死亡率高[5-6]等情況。在高密度集約化養(yǎng)殖中,特別是當(dāng)水的交換受到限制時(shí),水中的氨氮會逐漸積累,導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物受到持續(xù)性的氨氮脅迫,甚至水體中的氨氮含量可能會在短時(shí)間內(nèi)急劇升高,從而對水產(chǎn)動(dòng)物造成急性氨氮脅迫損傷[7-8]。
高濃度的非離子氨進(jìn)入水生動(dòng)物體內(nèi),可導(dǎo)致機(jī)體的組織器官受損。目前國內(nèi)外關(guān)于氨氮脅迫對水生動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道多集中在魚類、甲殼類和頭足類,如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[6]、虎斑烏賊(Sepiapharaonis)[9]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[10]、日本蟳(Charybdisjaponica)[11]、淇河鯽(Carassiusauratus)[12]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[13]等。然而氨氮脅迫對水生龜類組織結(jié)構(gòu)的影響尚未見報(bào)道。筆者通過觀察急性氨氮脅迫對中華條頸龜腦、肝臟、心臟、腎臟和脾臟的組織結(jié)構(gòu)影響以及脅迫后的恢復(fù)情況,揭示氨氮脅迫對中華條頸龜主要器官組織結(jié)構(gòu)的影響程度及脅迫后各器官的恢復(fù)能力,以期評估環(huán)境水體污染對養(yǎng)殖龜類的危害。
本試驗(yàn)在海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院龜鱉養(yǎng)殖室進(jìn)行。試驗(yàn)所用的中華條頸龜購自??阢r(nóng)業(yè)養(yǎng)殖有限公司。試驗(yàn)前,將體型較統(tǒng)一、活力好、健康的1齡個(gè)體[體質(zhì)量(218.26±12.65) g],暫養(yǎng)2周以適應(yīng)養(yǎng)殖室環(huán)境。暫養(yǎng)期間每周投喂2次,每日更換養(yǎng)殖用水,養(yǎng)殖水體pH 7.45±0.26,溶解氧(8.40±0.31) mg/L。正式試驗(yàn)時(shí),分為脅迫前(自來水)和試驗(yàn)組(氨氮質(zhì)量濃度200 mg/L),每組36只,分別在脅迫前、脅迫24 h、脅迫48 h和脅迫48 h后放入自來水中恢復(fù)48 h,在 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。采用氯化銨每日測定和調(diào)整總氨氮質(zhì)量濃度為200 mg/L。試驗(yàn)期間停止投喂。
取中華條頸龜腦、肝臟、心臟、腎臟和脾臟,用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液漂洗后放入多聚甲醛中固定。
常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度5 μm),50 ℃烘片,二甲苯脫蠟2次,并在連續(xù)的梯度乙醇(無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、75%乙醇)中進(jìn)行水合。脫蠟水合結(jié)束后用蘇木精—伊紅染色,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)下觀察和拍照。
氨氮脅迫前中華條頸龜腦結(jié)構(gòu)完整,神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞清晰可見(圖1a);氨氮脅迫24 h腦組織間質(zhì)增寬,少部分神經(jīng)元出現(xiàn)核偏位現(xiàn)象(圖1b);脅迫48 h部分神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹,細(xì)胞核偏位現(xiàn)象增加,部分細(xì)胞核溶解,僅剩細(xì)胞核輪廓,神經(jīng)元變性、壞死,神經(jīng)間質(zhì)增寬、疏松(圖1c);恢復(fù)48 h后神經(jīng)間質(zhì)增寬現(xiàn)象依舊存在,但神經(jīng)元腫脹與細(xì)胞核偏位現(xiàn)象有所減少(圖1d)。
圖1 氨氮脅迫對中華條頸龜腦組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of ammonia stress on histological brain structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前; b.脅迫24 h; c.脅迫48 h; d.恢復(fù)48 h; 標(biāo)尺為50 μm; N.神經(jīng)細(xì)胞; NL.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞; M.神經(jīng)組織間質(zhì); NO.核偏位; K.核溶解.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; N.nerve cell; NL.neurogliocyte; M.mesenchyme in neural tissue; NO.nuclear offset; K.karyolysis.
氨氮脅迫前中華條頸龜肝臟中肝細(xì)胞和中央靜脈清晰可見且結(jié)構(gòu)完整,肝血竇中分布有少量的色素細(xì)胞(圖2a);氨氮脅迫24 h少部分肝細(xì)胞出現(xiàn)體積增大、顆粒變性、水泡變性等病理現(xiàn)象(圖2b);脅迫48 h肝細(xì)胞腫脹現(xiàn)象增多,顆粒變性及水泡變性更為嚴(yán)重,肝血竇縮小甚至消失,部分肝細(xì)胞核溶解甚至消失(圖2c);恢復(fù)48 h后肝血竇基本恢復(fù)到脅迫前水平,肝細(xì)胞腫脹減少,但顆粒變性、水泡變性現(xiàn)象依舊存在(圖2d)。
圖2 氨氮脅迫對中華條頸龜肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of ammonia stress on histological liver structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前; b.脅迫24 h; c.脅迫48 h; d.恢復(fù)48 h; 標(biāo)尺為50 μm; H.肝細(xì)胞; HS.肝血竇; CH.色素細(xì)胞; CV.中央靜脈; GD.顆粒變性; VD.水泡變性; K.核溶解.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; H.hepatocytes; HS.hepaticsinusoid; CH.chromatophore; CV.central veins; GD.granular degeneration; VD.vesicular degeneration; K.karyolysis.
氨氮脅迫前中華條頸龜心臟組織結(jié)構(gòu)完整,可見心室肌細(xì)胞分支、橢圓形的心肌細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)(圖3a);氨氮脅迫24 h心肌細(xì)胞間隙增寬,間質(zhì)血管充血(圖3b);脅迫48 h心肌細(xì)胞間隙持續(xù)增寬,間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血更為嚴(yán)重(圖3c);恢復(fù)48 h后心肌細(xì)胞間隙縮小趨于脅迫前水平,充血現(xiàn)象消失(圖3d)。
圖3 氨氮脅迫對中華條頸龜心臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of ammonia stress on histological heart structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前; b.脅迫24 h; c.脅迫48 h; d.恢復(fù)48 h; 標(biāo)尺為50 μm; CM.心肌細(xì)胞; G.間隙血管; B.心肌細(xì)胞分支; BC.血細(xì)胞.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; CM.cardiac muscle cell; G.interstitial blood vessel; B.branch of cardiomyocytes; BC.blood cell.
氨氮脅迫前中華條頸龜腎臟組織的腎小管和腎小體均完整正常(圖4a);氨氮脅迫24 h腎小球體積增大,腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)擴(kuò)張,腎小管管腔縮小,腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生顆粒變性,細(xì)胞膜破裂,管腔內(nèi)出現(xiàn)紅染物質(zhì),間質(zhì)中有少量炎性細(xì)胞浸潤(圖4b);脅迫48 h腎小管上皮細(xì)胞輪廓不清,從基膜脫落,細(xì)胞膜破裂,核固縮甚至溶解消失,炎性細(xì)胞浸潤加重(圖4c);恢復(fù)48 h后炎性細(xì)胞基本消失,但腎小管管腔不規(guī)則和顆粒變性等病理現(xiàn)象依舊存在(圖4d)。
圖4 氨氮脅迫對中華條頸龜腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of ammonia stress on histological kidney structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前; b.脅迫24 h; c.脅迫48 h; d.恢復(fù)48 h; 標(biāo)尺為50 μm; G.腎小球; T.腎小管; BC.腎小囊; GD.顆粒變性; IC.炎性細(xì)胞; RT.腎小管管腔縮?。?M.腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞膜破裂; ND.細(xì)胞輪廓不清; K.核溶解; KA.核固縮; BMD.脫離基膜.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; G.glomerulus; T.kidney tubules; BC.Bowman′s capsule; GD.granular degeneration; IC.inflammatory cells; RT.reduction in space inside renal tubules; M.membranolysis; ND.the cells are not well defined; K.karyolysis; K.karyopyknosis; BMD.basement membrane detachment.
氨氮脅迫前,中華條頸龜脾臟組織網(wǎng)狀支架上分布密集的淋巴細(xì)胞,被膜下有由紅髓和白髓交替分布形成的脾實(shí)質(zhì)(圖5a);氨氮脅迫24 h,中華條頸龜脾臟表現(xiàn)為白髓區(qū)域增大,淋巴細(xì)胞明顯增多,紅髓區(qū)域略有減小(圖5b);脅迫48 h,中華條頸龜脾臟白髓區(qū)域持續(xù)增大,中央動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,紅髓區(qū)域面積明顯減小(圖5c);恢復(fù)48 h后,中華條頸龜脾臟組織白髓和紅髓結(jié)構(gòu)趨于正常(圖5d)。
圖5 氨氮脅迫對中華條頸龜脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of ammonia stress on histological spleen structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前; b.脅迫24 h; c.脅迫48 h; d.恢復(fù)48 h; 標(biāo)尺為50 μm; WP.白髓; RP.紅髓; PALS.動(dòng)脈周圍淋巴鞘; CA.中央動(dòng)脈.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; WP.white marrow; RP.red marrow; PALS.periarterial lymphatic sheath; CA.central artery.
爬行動(dòng)物的腦組織可分為大腦、間腦、中腦、小腦及延腦5個(gè)主要部分。腦組織是機(jī)體的神經(jīng)中樞,調(diào)控機(jī)體的各種生理機(jī)能。吳利敏等[12]對淇河鯽的研究表明,急性氨氮脅迫會導(dǎo)致其腦組織神經(jīng)纖維被破壞,分泌細(xì)胞與支持細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的壞死;而陳思涵等[9]對虎斑烏賊的研究表明,急性氨氮脅迫不會對其腦組織神經(jīng)纖維、分泌細(xì)胞和支持細(xì)胞造成損傷。在本試驗(yàn)中,中華條頸龜大腦在氨氮脅迫后出現(xiàn)腦組織間質(zhì)增寬,神經(jīng)元腫脹,神經(jīng)元細(xì)胞核偏位,甚至出現(xiàn)神經(jīng)元變性、壞死等現(xiàn)象,說明氨氮脅迫會對中華條頸龜腦組織造成損傷,這種損傷可能與腦細(xì)胞中的神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸合成受阻和谷氨酰胺大量合成導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)平衡被打破有關(guān)[12]?;謴?fù)48 h后其神經(jīng)元腫脹與細(xì)胞核偏位現(xiàn)象有所減少,說明腦組織具有一定的修復(fù)能力,但48 h恢復(fù)不足以完全修復(fù)氨氮脅迫造成的損傷。
肝臟是龜類重要的解毒器官,同時(shí)也是各種關(guān)鍵代謝途徑的主要器官,化學(xué)物質(zhì)的毒性作用主要出現(xiàn)在肝臟中[6]。王貞杰等[14]對圓斑星鰈(Veraspervariegatus)的研究表明,急性氨氮脅迫后會出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹和溶解,細(xì)胞輪廓模糊,細(xì)胞水樣變性及空泡化等現(xiàn)象;郝小鳳等[15]對泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)的研究表明,氨氮脅迫會使其產(chǎn)生肝細(xì)胞腫脹,線粒體數(shù)量減少,核膜破損等現(xiàn)象;而Liang等[5]對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的研究表明,96 h氨氮脅迫后肝胰腺未出現(xiàn)明顯的組織學(xué)損傷。中華條頸龜肝實(shí)質(zhì)由許多肝小葉和極少量的間質(zhì)構(gòu)成,肝實(shí)質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織少,肝小葉分界不清楚[16]。在本試驗(yàn)中,中華條頸龜肝臟在氨氮脅迫后出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹,細(xì)胞變性,肝血竇縮小甚至消失,細(xì)胞核溶解甚至消失等現(xiàn)象,說明急性氨氮脅迫會對中華條頸龜?shù)母闻K組織造成損傷,并且損傷與脅迫時(shí)間呈正相關(guān),這可能與機(jī)體在高含量氨氮脅迫下超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性被抑制,機(jī)體抗氧化能力下降[13]有關(guān);同時(shí),機(jī)體免疫能力的下降可能會影響肝臟正常的解毒及代謝功能,進(jìn)而導(dǎo)致有毒物質(zhì)在體內(nèi)積累,造成進(jìn)一步的損傷?;謴?fù)48 h后肝臟肝血竇恢復(fù)到脅迫前水平,肝細(xì)胞腫脹減少,但顆粒變性、水泡變性現(xiàn)象依舊存在,說明肝臟具有一定的修復(fù)能力,但恢復(fù)48 h不足以完全修復(fù)脅迫造成的損傷。
心臟是機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分,是促進(jìn)血液流動(dòng)的動(dòng)力泵,通過其收縮和舒張將血液輸入動(dòng)脈。不同種類的應(yīng)激或脅迫會對心臟產(chǎn)生一定程度的損傷,如雷雯雯[17]的研究表明,鎘暴露會導(dǎo)致長江華溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)心臟出現(xiàn)心肌水腫、空泡變性、玻璃樣變性和炎癥細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象;王來等[18]對大鼠(Rattusnorvegicus)的研究表明,鎘會引起心臟心肌細(xì)胞腫脹、心肌纖維增多、閏盤受到損傷等病理現(xiàn)象。中華條頸龜?shù)男呐K分為兩心房和兩心室,左右心室由不完全隔膜分開,心肌細(xì)胞呈束狀,核橢圓形,相鄰的心肌細(xì)胞連接處有閏盤結(jié)構(gòu)[16]。在本試驗(yàn)中,中華條頸龜心臟在氨氮脅迫后出現(xiàn)心室肌細(xì)胞間隙增寬,間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血等現(xiàn)象,說明氨氮脅迫會對中華條頸龜心臟組織造成損傷,可能導(dǎo)致心臟供血能力下降,影響營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和吸收?;謴?fù)48 h后間隙縮小趨于脅迫前水平,充血現(xiàn)象消失,說明心臟組織面對氨氮脅迫造成的損傷具有較好的修復(fù)能力。
腎臟是龜類主要的排泄器官,也是解毒器官之一。機(jī)體新陳代謝的產(chǎn)物通過腎臟排出體外,同時(shí)腎臟還能調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓和離子平衡。吳利敏等[12]研究發(fā)現(xiàn),氨氮脅迫會導(dǎo)致淇河鯽腎臟組織出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤、腎小管管腔縮小、腎小囊腔擴(kuò)大等組織病變;張武肖等[10]研究發(fā)現(xiàn),氨氮脅迫會造成團(tuán)頭魴腎臟組織產(chǎn)生腎小球萎縮,腎小管上皮細(xì)胞腫大、壞死、空泡化,腎小管壞死等組織病變;Mishra等[19]研究發(fā)現(xiàn),重鉻酸鉀導(dǎo)致翠鱧(Channapunctata)腎臟組織出現(xiàn)腎小管管腔縮小、腎小囊腔擴(kuò)大、腎小管上皮細(xì)胞腫大等組織病變;Benli等[6]對尼羅羅非魚的研究表明,氨氮脅迫后腎臟組織出現(xiàn)腎小球腎炎和充血等組織病變。本試驗(yàn)中,氨氮脅迫后中華條頸龜腎臟表現(xiàn)出腎小管管腔縮小,腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生顆粒變性,核固縮甚至溶解消失,說明高含量氨氮作用于腎小管上皮細(xì)胞后,導(dǎo)致腎小管發(fā)生損傷,進(jìn)而可能導(dǎo)致腎臟重吸收和排泄能力下降、破壞機(jī)體體液平衡及破壞機(jī)體的酸堿平衡;腎臟中炎性細(xì)胞浸潤,說明氨氮誘發(fā)了腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)?;謴?fù)48 h后腎臟中炎性細(xì)胞基本消失,但腎小管管腔不規(guī)則、顆粒變性等病理現(xiàn)象依舊存在;說明腎臟有一定的修復(fù)能力,但48 h恢復(fù)不足以完全修復(fù)脅迫造成的損傷。
脾臟是機(jī)體最大的淋巴器官,在造血、免疫等方面發(fā)揮著重要作用。王曉杰等[20]研究發(fā)現(xiàn),鹽度脅迫下許氏平鲉(Sebastesschlegeli)脾臟組織中淋巴細(xì)胞明顯增加,且呈聚集現(xiàn)象;王文博等[21]對草魚(Ctenopharyngodonidellus)的研究表明,擁擠脅迫會導(dǎo)致脾臟出現(xiàn)明顯萎縮;劉奇奇等[22]研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)輸脅迫會對四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)幼魚脾臟造成損傷,表現(xiàn)為白髓、紅髓和邊緣區(qū)區(qū)域變小,巨噬細(xì)胞中心數(shù)量減少。中華條頸龜?shù)钠⑴K為棕褐色實(shí)質(zhì)器官,較小,豆形;被膜較薄,由致密結(jié)締組織組成,表面覆蓋單層扁平上皮細(xì)胞;可分為白髓和紅髓兩部分[16]。中央動(dòng)脈周圍密集排列大量淋巴細(xì)胞,形成動(dòng)脈周圍淋巴鞘;動(dòng)脈周圍淋巴鞘和淋巴小結(jié)組成白髓。紅髓由脾索和脾竇組成。氨氮脅迫后中華條頸龜脾臟白髓區(qū)域增大,淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加,說明氨氮脅迫促使中華條頸龜?shù)拿庖呒?xì)胞增殖,其特異性免疫應(yīng)答能力增強(qiáng)。恢復(fù)48 h后,白髓和紅髓區(qū)域趨于正常,淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常,說明機(jī)體內(nèi)的有害物質(zhì)減少,脾臟的免疫應(yīng)答能力恢復(fù)到正常水平。
通過組織切片分析可知,急性氨氮脅迫下,腦、肝臟、心臟及腎臟組織都受到不同程度的損傷,從本試驗(yàn)來看,損傷相對嚴(yán)重的是肝臟和腎臟;脾臟作為機(jī)體的免疫器官,在脅迫發(fā)生后能夠迅速啟動(dòng)特異性免疫反應(yīng),清除機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)的有害物質(zhì)。脅迫后恢復(fù)試驗(yàn)表明,中華條頸龜腦、肝臟、心臟及腎臟等器官組織均表現(xiàn)出可恢復(fù)性,其中心臟恢復(fù)能力較好,腦、肝臟和腎臟恢復(fù)能力相對較差。綜上所述,在養(yǎng)殖中應(yīng)當(dāng)注意水質(zhì)的監(jiān)測和管理,防止出現(xiàn)氨氮對中華條頸龜?shù)亩拘孕?yīng)。
致 謝
感謝河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院康靜靜博士在組織病理讀片中給予的指導(dǎo)和幫助。