王 偉，劉 穎，黃 芳，何 鑫，袁 傲，靳 欽，朱惠君，劉益飛

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，江蘇 226001）

近年來肺癌已成為世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率高[1]，85%以上肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。由于NSCLC的高度侵襲性和對治療的耐受性，易侵犯淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率小于15%[2]，早期診斷和綜合治療是降低死亡率的關(guān)鍵。

受體酪氨酸激酶包含16個成員，分為EphA和EphB亞家族，其中EphA1-8、EphA10和EphB1-3與細(xì)胞表面配體Ephrin-A1-5和Ephrin-B結(jié)合[3]介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，在上皮細(xì)胞中起著重要作用[4]。研究表明，EphA8（ephrin type-A receptor 8）與多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-6]。本文收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2010年1月—2017年12月167例NSCLC腫瘤組織石蠟樣本，制作組織芯片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測EphA8表達(dá)情況，回顧性分析EphA8表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷為NSCLC的腫瘤組織石蠟標(biāo)本167例，其中男性92例，女性75例，年齡36～80歲，平均60±9歲，有吸煙史32例；腫瘤直徑<3 cm 48例，≥3 cm 119例。腫瘤分期按照第八版TNM分期指南。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理研究委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)分析 組織芯片又稱組織微陣列（TMA），其制作按照蘇木精-伊紅染色（H&E）結(jié)果，選擇代表性癌區(qū)標(biāo)記在石蠟塊中，獲得直徑2 mm TMA樣品。對TMA連續(xù)切片，切片厚度為4μm。經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度濃度酒精脫水后，用檸檬酸鹽溶液（pH 6.0）加壓煮沸20 min進(jìn)行抗原修復(fù)。自然冷卻至室溫后，以3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，10%山羊血清封閉，以EphA8單克隆抗體（1∶200，OMI189940，Omnimabs，NJ）孵育，4℃冰箱過夜。次日復(fù)溫后加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（Dako，Carpinteria，CA，USA）孵育，DAB顯色，蘇木素染胞核1 min，脫水，透明，封片，晾干。以PBS代替一抗作為空白對照。

1.3 染色結(jié)果觀察 采用半定量雙盲法評估，由兩位主治以上病理學(xué)醫(yī)師在顯微鏡下獨(dú)立閱片。細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，染色強(qiáng)度計分:陰性0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強(qiáng)陽性3分。按陽性染色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比評分:0分，無陽性染色；1分，陽性細(xì)胞<25%；2分，陽性細(xì)胞25%～50%；3分，陽性細(xì)胞＞50%。細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度計分乘以染色陽性細(xì)胞占比評分為最終染色評分，<6分為EphA8低表達(dá)，≥6分為EphA8高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Pearsonχ2檢驗分析EphA8表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，單因素和多因素COX回歸模型分析影響預(yù)后的相關(guān)因素。繪制Kaplan-Meier累積生存率曲線，運(yùn)用log-rank法比較生存率的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EphA8表達(dá)水平與NSCLC臨床病理特征的相關(guān)性 167例NSCLC腫瘤組織中91例（54.5%）EphA8高表達(dá)，EphA8表達(dá)水平與腫瘤大小（P<0.001）、TNM分期（P=0.001）、原發(fā)腫瘤分級（P<0.001）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.035）有關(guān)，而與年齡、性別、吸煙史、分化程度、病理分類及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。見表1。

表1 EphA8蛋白表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 例（%）

2.2 影響NSCLC患者預(yù)后的因素分析 單因素Cox回歸分析顯示，EphA8表達(dá)水平（HR=1.474，P=0.030）和腫瘤大?。℉R=1.722，P=0.012）是影響NSCLC患者生存率的重要因素。多因素Cox回歸模型分析顯示，EphA8表達(dá)水平（P=0.046）和腫瘤大小（P=0.018）是NSCLC獨(dú)立的預(yù)后因素，EphA8高表達(dá)、腫瘤體積大預(yù)示NSCLC患者預(yù)后不良。見表2。Kaplan-Meier生存曲線顯示，EphA8高表達(dá)患者5年總生存率低于EphA8低表達(dá)患者，腫瘤直徑≥3 cm患者5年總生存率低于腫瘤直徑<3 cm患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、圖2。

圖2 腫瘤大小與NSCLC患者總體生存率分析

表2 EphA8蛋白表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

圖1 EphA8表達(dá)與NSCLC患者總生存率分析

3 討 論

在神經(jīng)元和血管組織中首次發(fā)現(xiàn)的Ephs和Ephrins是受體酪氨酸激酶中最大的家族，Ephs/Ephrins信號通路參與許多重要的生物發(fā)育和細(xì)胞過程，如軸突引導(dǎo)[7]和血管生成[8]。Ephs/Ephrins幾乎在所有類型腫瘤組織中表達(dá)，可能通過促進(jìn)血管化過程來增強(qiáng)腫瘤生長能力[8-9]，其過度表達(dá)可阻礙細(xì)胞粘附，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。Ephs參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移[10]，許多Ephs家族成員在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于原發(fā)腫瘤，其表達(dá)水平往往與腫瘤惡性程度和侵襲性有關(guān)[11]。EphA1過表達(dá)與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)[12]，EphA2促進(jìn)胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換[13]，促進(jìn)結(jié)腸癌[14]、前列腺癌[15]發(fā)生發(fā)展，在胃癌組織中EphA3表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤血管生成和預(yù)后相關(guān)[16]。

EphA8是Ephs RTKs亞家族的受體之一，通過與GPI錨定的Ephrin-A2、A3和A5結(jié)合而發(fā)揮作用。EphA8-Fc以caspase依賴方式增加Ephrin-A5表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[17]。越來越多的研究表明，EphA8是調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的重要參與者。在膠質(zhì)瘤中miR-10a靶向下調(diào)EphA8 mRNA表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[5]。在舌癌[6]、卵巢癌[7]、結(jié)腸癌和胃癌[8]組織中EphA8 mRNA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的增殖，侵襲和遷移。對不同腫瘤組織中EphA8表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析表明，EphA8可能是一種促癌基因[18]。

本研究選擇NSCLC為研究對象，旨在探討EphA8在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性以及對患者預(yù)后的影響。結(jié)果顯示，EphA8表達(dá)水平與腫瘤大?。≒<0.001）、TNM分期（P=0.001）、原發(fā)腫瘤分級（P<0.001）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.035）有關(guān)。單因素Cox回歸分析顯示，EphA8表達(dá)水平（HR=1.474，P=0.030）和腫瘤大小（HR=1.722，P=0.012）是影響NSCLC患者生存率的重要因素。多因素Cox回歸模型分析顯示，EphA8表達(dá)水平（P=0.046）和腫瘤大?。≒=0.018）是NSCLC獨(dú)立的預(yù)后因素。Kaplan-Meier生存曲線顯示，EphA8高表達(dá)患者5年總生存率低于EphA8低表達(dá)患者，腫瘤直徑≥3 cm患者5年總生存率低于腫瘤直徑<3 cm患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明EphA8高表達(dá)與NSCLC患者的不良預(yù)后有關(guān)，與舌癌[4]、卵巢癌[5]、結(jié)腸癌和胃癌[6]的研究結(jié)果相似。然而，單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示TNM分期與預(yù)后無相關(guān)性，這可能是因為TNM分期的制定基于大樣本數(shù)據(jù)，而本研究樣本數(shù)較少，所以并沒有顯著性差異。

綜上所述，EphA8可作為監(jiān)測NSCLC患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，有望為精準(zhǔn)治療提供新的策略。但本研究僅限于臨床觀察，今后需擴(kuò)大樣本量，并深入探討EphA8在NSCLC中的分子作用機(jī)制。