梅 鑫，文治瑞，劉金香，楊再波，周才碧,

（1.黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院, 貴州都勻 558000；2.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 貴州貴陽 550000；3.黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院, 貴州都勻 558000）

長期食用高熱量食物會(huì)使過多的脂肪沉積在人體或肝臟內(nèi)導(dǎo)致肥胖，從而引起各種慢性疾病如高脂血癥、糖尿病、心腦血管疾病的發(fā)生。高脂血癥是脂質(zhì)代謝性疾病，與脂肪肝、糖尿病、冠心病等多種疾病密切相關(guān)[1-2]，其發(fā)病率逐年上升且呈低齡化趨勢，已發(fā)展為全球性公共衛(wèi)生問題[3]。高脂血癥的發(fā)病與血清中的TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、LDL(低密度脂蛋白)、HDL(高密度脂蛋白)的指標(biāo)異常息息相關(guān)[4-5]，長期高脂血癥作用下，LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)可通過受損內(nèi)皮進(jìn)入血管內(nèi)膜，引起內(nèi)皮細(xì)胞一系列的化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)氧化脂質(zhì)的積累，并影響CRP (C-反應(yīng)蛋白)、TNF-α(α腫瘤壞死因子)、IL-10 (白介素10)等前炎癥因子的釋放[6-7]。相關(guān)研究報(bào)道脂代謝異常與基因的表達(dá)存在一定的關(guān)系，與AMPKα-2、HMGCR、FXR、PPARa、LDLR、LPL、CETP等基因表達(dá)成正相關(guān)且與ACC1、SREBP1C、ACC、PPARr、FAS等基因表達(dá)成負(fù)相關(guān)[8-11]。此外，高脂血癥發(fā)病是多種代謝通路異常的綜合結(jié)果，主要包括脂類代謝、糖類代謝、氨基酸代謝以及氧化應(yīng)激等[12]，其差異代謝產(chǎn)物相關(guān)信息有助于診斷高脂血癥的發(fā)病過程。

目前，市場上品種繁多的降脂藥物，大多成本高價(jià)格貴，且易出現(xiàn)肝臟毒性、劑量依賴性等副作用[13]；低毒性或保肝的降血脂藥物開發(fā)是一個(gè)具有良好前景的發(fā)展方向，茶作為一種僅次于水的世界上最廣泛消費(fèi)的飲料因其降脂減肥功效備受人們的關(guān)注[14]。人體脂質(zhì)代謝過程復(fù)雜，茶葉中的茶多酚、咖啡堿、兒茶素茶多糖等[15-20]，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[21]，抑制FAS基因的表達(dá)[14]，激活肝臟中的脂肪分解代謝[22-23]，減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積和血清TC的水平[24]，從而達(dá)到降脂、減肥的功效。敬娜娜等[25]研究了茯磚茶對(duì)高脂血癥小鼠脂代謝的影響，發(fā)現(xiàn)茯磚茶水提物能抑制體內(nèi)脂肪合成的關(guān)鍵基因表達(dá)，減少脂肪的堆積，從而達(dá)到降脂的效果。有報(bào)道稱，普洱茶能抑制體重增加、緩解氧化損傷和低度炎癥、調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平等[26]。

代謝組學(xué)是對(duì)有機(jī)酸、脂類、氨基酸、糖類等相關(guān)代謝產(chǎn)物分析的一門技術(shù)[27]，與其他三大組學(xué)（mRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及DNA基因組學(xué)）共同構(gòu)建成生物系統(tǒng)四大組學(xué)；其具有整體性、動(dòng)態(tài)性、系統(tǒng)性、綜合性等特點(diǎn)[28]，且代謝產(chǎn)物的種類較少、相似性高以及研究手段與技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域中通用等優(yōu)點(diǎn)[29]。本研究以高脂血癥小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，灌胃不同濃度復(fù)合茶水提物，飼養(yǎng)30 d后；利用超高效液相色譜技術(shù)檢測小鼠肝臟脂類代謝物，通過PCA分析、OPLS-DA模型分析以及代謝通路分析等挖掘不同濃度復(fù)合茶水提物處理小鼠肝臟的差異脂代謝物，旨在于探索復(fù)合茶的降脂作用與機(jī)理，為該復(fù)合茶的研究開發(fā)和利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復(fù)合綠茶由都勻古樹綠茶、都勻闊葉苦丁、都勻原樹甜茶、荷葉、野薄荷、金銀花拼配而成，其比例為2:2:1:1:1:1 貴州碧豎科技服務(wù)有限公司；乙醇、乙腈、甲醇 均為色譜純，德國Merck；雄性KM小鼠（SPF級(jí)） 5周齡，體重（30±2）g，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，湖南斯萊克。

IT-TOF質(zhì)譜儀（含系統(tǒng)控制器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)）、CTO-20AC柱溫箱、LC-30AD液相輸液泵 日本島津公司；超純水器、超低溫冰箱、Hettich MIKRO-22R低溫高速離心機(jī) 美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶樣制備 將復(fù)合茶干茶樣品粉碎400目，按茶葉與水的重量比1:10（w/v）置于100 ℃沸水中浸提30 min，過濾后減壓濃縮。茶渣按相同的方法再提取一次，后將兩次濾液混合。置于-80 ℃下預(yù)冷12 h后真空干燥30 h，然后收集干粉并貯存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn) 將SPF級(jí)雄性KM小鼠，喂養(yǎng)7 d，將其隨機(jī)分成復(fù)合茶高劑量組（DH）、復(fù)合茶低劑量組（DL）和模型對(duì)照組（NK），每組10只小鼠；NK組飼喂高脂飼料+灌胃蒸餾水（0.1 mL/10 g），DL組飼喂高脂飼料+灌胃210.0 mg/kg復(fù)合茶湯，DH組飼喂高脂飼料+灌胃840.0 mg/kg復(fù)合茶湯。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)濕度為50%～60%，溫度為20～26 ℃，光照12 h/d，將各組小鼠分開飼養(yǎng)。每天更換一次墊料，每周更換飲用蒸餾水。實(shí)驗(yàn)30 d期間，如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)前后小鼠的生理狀況和體重等變化。

1.2.3 樣品制備 飼養(yǎng)結(jié)束后，取出小鼠肝組織，取50 mg，加入1000 μL預(yù)冷提取劑（70%的甲醇水溶液，含1 μg/mL的2-氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)），勻漿3 min（加入預(yù)冷鋼珠）；取出鋼珠，渦旋1 min，冰箱靜置15 min，再4 ℃離心（12000 r/min）10 min，取上清液，用于LC-MS/MS分析。

1.2.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.2.4.1 LC條 件 色 譜 柱：Waters ACQUITY UPLCHSS T3C18，1.8 μm×2.1 mm×100 mm；柱溫40 ℃；流動(dòng)相：A為超純水（0.04%乙酸），B為乙腈；洗脫梯度見表1；進(jìn)樣量2 μL。

表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient

1.2.4.2 MS條件 質(zhì)譜條件：GSI（離子源氣體I）55 psi、溫度為500 ℃電噴霧離子源、氣簾氣26 psi、氣體II（GS II）60 psi、質(zhì)譜電壓為-4500 V（negative）和500 V（positive）、Collision-Activated Dissociation，CAD參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿（Qtrap）中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)DP（優(yōu)化的去簇電壓）和CE（碰撞能）進(jìn)行掃描檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Analyst1.6.3軟件及三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)及進(jìn)行定量分析，對(duì)所有代謝物進(jìn)行峰提取和峰校正。所有數(shù)據(jù)集經(jīng)過處理后用OPLS-DA模型進(jìn)行分析，以預(yù)測參數(shù)R2X、R2Y和Q2的值來評(píng)價(jià)模型的有效性，它們的大小直接反映了模型的可靠程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合茶對(duì)高脂血癥小鼠體重的影響

經(jīng)過1個(gè)月的試驗(yàn)干預(yù)，觀察高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體重變化（表2），高脂模型組小鼠的最終體重比造模初期的體重增加（22.2±1.7）g，且比常規(guī)飼料組顯著增重，前期研究結(jié)果表明高脂模型建模成功[30]。而經(jīng)過不同濃度復(fù)合茶灌胃，DL組和DH組小鼠的最終體重較NK組極顯著下降（P＜0.01），說明復(fù)合茶能夠控制由高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重增加，且呈劑量依賴模式。

表2 復(fù)合茶對(duì)高脂血癥小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of compound tea on the body weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

表2 復(fù)合茶對(duì)高脂血癥小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of compound tea on the body weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

注：同一指標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著，P＜0.05；不同大寫字母表示差異極顯著，P＜0.01。

?

2.2 樣本質(zhì)譜分析總離子流圖

利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。為了監(jiān)控分析過程的可重復(fù)性，在分析過程中每10個(gè)測試樣品插入1個(gè)混合樣品提取物制備的質(zhì)量控制（QC）樣品。質(zhì)譜法總離子流圖（Totalionscurrent，TIC）可通過疊加顯示來分析代謝物的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。MRM代謝物檢測多峰圖，用縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)分別表示為：離子檢測的離子流強(qiáng)度和代謝物檢測的保留時(shí)間。每種顏色的質(zhì)譜峰代表檢測到的不同代謝物，峰面積代表相應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量（圖1）。

圖1 混樣質(zhì)控QC樣本的總離子流圖Fig.1 Total ion flow pattern of QC samples with mixed quality control

2.3 定性和定量代謝物

基于數(shù)據(jù)庫MetWare databa（MWDB）、KEGG和多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）進(jìn)行定性和定量質(zhì)譜分析，由樣品的代謝物檢測多峰圖（MRM）可知，共檢測到110種脂代謝物，包括溶血卵磷脂酰膽堿18:2、（±）17-羥基-5Z，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸、前列腺素E2、溶血卵磷脂酰乙醇胺14:0、（±）12（13）環(huán)氧-9Z-十八碳烯酸、十四烷二酸、溶血卵磷脂酰絲氨酸22:5、2-甲基丁酰肉毒堿、DL-芐基琥珀酸、枯茗醛、溶血卵磷脂酰膽堿20:2、前列腺素D2等代謝物質(zhì)。根據(jù)保留時(shí)間與峰型的信息，校正不同樣本中每個(gè)代謝物的色譜峰，以確保定性定量的準(zhǔn)確性，比較110種脂代謝物中每個(gè)代謝物在不同樣本中的物質(zhì)含量差異（圖2）。

圖2 代謝物定量分析積分矯正Fig.2 Integral correction chart for quantitative analysis of metabolites

2.4 PCA分析

根據(jù)mix即上方提到的質(zhì)控樣本，分析顯示：樣品具有相似的代謝特性，每組處理內(nèi)樣品間的差異都很小，測試結(jié)果穩(wěn)定且可重復(fù)。茶樣處理之間的分離趨勢很明顯，表明不同濃度茶樣處理之間存在明顯的代謝差異（圖3d）；三組處理的代謝物在第一個(gè)成分（PC1）中明顯分離，表明茶樣處理對(duì)高脂小鼠的脂代謝有明顯影響（圖3a～c）。

根據(jù)PCA得分圖分析NK、DL組，NK、DH組和DL、DH組都能形成部分分離，表明不同濃度的茶樣處理組與模型組在小鼠的代謝上具有一定的差異（圖3a～c）。

圖3 主成分分析（PCA）得分圖和三維圖Fig.3 Principal component analysis （PCA） score map and 3D map

2.5 OPLS-DA模型分析

OPLS-DA可最大程度地區(qū)分組間差異，有助于發(fā)現(xiàn)差異代謝物。對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行了200次排列組合試驗(yàn)（圖4），水平線對(duì)應(yīng)于原始模型的R2和Q2，而紅色和藍(lán)色點(diǎn)分別代表替換后的R2’和Q2’；驗(yàn)證結(jié)果表明該模型是有意義的，并且可以在隨后的分析中根據(jù)VIP值分析篩選差異代謝物。

在DL組對(duì)NK組、DH組對(duì)NK組、DH組對(duì)DL組的比較中，R2Y和Q2的分?jǐn)?shù)均大于0.99（圖4a～c），表明茶樣處理導(dǎo)致高脂小鼠的脂代謝差異。此外，OPLS-DA模型顯示，DH組小鼠的代謝物分布較為分散，這可能與高濃度復(fù)合茶處理的小鼠體內(nèi)代謝之間產(chǎn)生的個(gè)體差異有關(guān)，同時(shí)也反應(yīng)了代謝組學(xué)技術(shù)能夠準(zhǔn)確反映個(gè)體代謝物差異特征的優(yōu)點(diǎn)（圖4b～c）。

圖4 OPLS-DA模型的評(píng)分、驗(yàn)證圖Fig.4 Scoring and validation of OPLS-DA model

2.6 差異代謝物篩選

隨著茶樣濃度的增加，代謝物的差異加大（圖5d）。HCA可以評(píng)價(jià)復(fù)合茶樣處理導(dǎo)致代謝物積累的特性差異，包括處理內(nèi)同質(zhì)性和處理間變異性?；鹕綀D中的點(diǎn)代表代謝物，縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)代表代謝物VIP值和兩個(gè)樣品中代謝物定量差異的對(duì)數(shù)。選擇折疊變化≥2，折疊變化≤0.5，VIP≥1的代謝物作為顯著差異代謝物。由差異代謝火山圖可知大多數(shù)代謝物的表達(dá)沒有差異，上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物個(gè)數(shù)相近（圖5c）；NK VS DL組中上調(diào)5個(gè)，NK VS DH組中下調(diào)15個(gè)，上調(diào)1個(gè)，DL VS DH組中下調(diào)11個(gè)。

圖5 差異代謝物的條形值圖、VIP值圖、相關(guān)性熱圖、火山圖、各組差異韋恩圖Fig.5 Bar graph, VIP value map, correlation thermogram, volcano map and Venn diagram of different metabolites

2.7 差異代謝物的統(tǒng)計(jì)分析

續(xù)表 3

由表3可知，共檢測到110個(gè)代謝物，其中22個(gè)代謝物差異明顯（表3）。與模型對(duì)照組小鼠相比，復(fù)合茶低濃度處理組中：（±）7-羥基-4Z, 8E, 10Z,13Z, 16Z, 19Z-二十二碳六烯酸、十四烷二酸和（±）-15-羥基-5Z, 8Z, 11Z, 13E, 17Z-二十碳五烯酸等代謝產(chǎn)物上調(diào)。復(fù)合茶高濃度處理組中的溶血卵磷脂酰乙醇胺14:0（LPE14:0）、溶血卵磷脂酰膽堿16:1（LPC16:1）、溶血卵磷脂酰膽堿18:1（LPC18:1）、溶血卵磷脂酰膽堿18:2（LPC18:2）、溶血卵磷脂酰膽堿20:2（LPC20:2）、溶血卵磷脂酰絲氨酸22:5（LPS22:5）、6-酮前列腺素F1α、前列腺素D2等代謝物質(zhì)下調(diào)，而（±）17-羥基-5Z, 8Z, 11Z, 14Z -二十碳四烯酸上調(diào)。

表3 差異顯著的代謝物Table 3 The metabolites with significant difference

2.8 代謝物的代謝通路分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫中的代謝通路分析差異代謝產(chǎn)物（圖6～圖9）。其代謝途徑的類型分為：二甲苯降解、甘油磷脂代謝、芳香化合物降解、亞油酸代謝和花生四烯酸代謝等代謝途徑。其中，LPS（22:5）、LPE（14:0）、DL-芐基琥珀酸、甘油、前列腺素D2、前列腺素E2、LPC（16:1）等代謝產(chǎn)物的含量在這些代謝通路抗氧化降脂分解和維持體內(nèi)血糖平衡方面發(fā)揮重要作用。并從DH組差異代謝的明顯可知（圖7）：復(fù)合茶對(duì)高脂小鼠的降脂與濃度有一定關(guān)系。

圖6 差異代謝物的功能注釋和富集分析Fig.6 Functional annotation and enrichment analysis of different metabolites

圖7 茶樣處理高脂小鼠肝臟脂質(zhì)代謝反應(yīng)Fig.7 Lipid metabolism in liver of high fat mice treated with tea

圖8 差異代謝物KEGG通路圖Fig.8 KEGG pathway of different metabolites

圖9 茶樣處理下高脂小鼠肝臟代謝反應(yīng)的研究概況Fig.9 Research overview of liver metabolic reaction of high fat mice under tea like treatment

3 討論與結(jié)論

基于UPLC-MS/MS 檢測平臺(tái)，方便、快速、準(zhǔn)確的質(zhì)譜定量測定代謝物在肝臟、血液中的濃度發(fā)生的一系列變化[31]。該方法為差異代謝物質(zhì)引起高脂血癥的變化狀況的評(píng)估提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥小鼠模型探討了復(fù)合茶提取物的降脂減肥功效。結(jié)果表明，復(fù)合茶能夠抑制肥胖小鼠的體重增長，以高劑量組的效果最佳。

溶血卵磷脂（Lysophosphatidylcholine，LPCs）可分為LPC，LPE，LPI，LPA等，它是細(xì)胞膜和介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，臨床上根據(jù)其水平變化來診斷病理病因。多項(xiàng)研究表明，LPCs在許多疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，包括高脂血癥、高血糖、動(dòng)脈粥樣硬化及炎癥等。有相關(guān)報(bào)道，血脂水平的變化與LPCs存在緊密相聯(lián)且復(fù)雜的關(guān)系[32]，當(dāng)LPCs與膽固醇及膽汁酸三者的比值達(dá)到一定程度時(shí)，膽固醇因飽合而結(jié)晶；且LPCs的形成是通過卵磷脂在磷脂酶A的作用下生成的[31]，其含量改變與高脂血癥引起的脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。因此，肥胖小鼠體內(nèi)LPCs的變化可作為診斷高脂血癥的潛在標(biāo)志物[33]。在本研究中，與高脂模型組對(duì)比，高 劑 量 復(fù) 合 茶 組 的LPC（16:1）、LPC（18:1）、LPC（18:2）、LPC（20:2）、LPS（22:5）和LPE（14:0）的水平顯著降低，因此，可推測復(fù)合茶提取物對(duì)LPCs的作用可能有助于降低血脂，其機(jī)理有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

十八碳烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等是不飽和脂肪酸。其中，二十二碳六烯酸是二十四碳六烯酸經(jīng)過C24: 6n-3到 C22: 6n-3的脂肪酸的β氧化反應(yīng)產(chǎn)生的[5]，降低的二十二碳六烯酸與脂肪酸β-氧化有關(guān)，高劑量復(fù)合茶提取物改善了高脂飲食小鼠代謝物的脂肪酸β-氧化異常癥狀。此外，二十碳五烯酸能改善血清脂肪質(zhì)量，有效降低血液中LDL-C和中性脂肪的含量，增加HDL-C含量。本研究中高濃度復(fù)合茶對(duì)二十碳五烯酸的作用可能有助于改善血脂異常。

前列腺素是一種炎癥介質(zhì)，通過環(huán)氧合酶產(chǎn)生花生四烯酸，該物質(zhì)具有生物活性。且相關(guān)研究報(bào)道：炎癥介質(zhì)和胰島素敏感性在小鼠疾病模型中存在正相關(guān)關(guān)系[34]。本研究中，與高脂模型組對(duì)比，高濃度復(fù)合茶處理組小鼠體內(nèi)前列腺素的含量有所下調(diào)。因此推測，復(fù)合茶可以一定程度的控制高脂膳食誘導(dǎo)引起的機(jī)體炎癥反應(yīng)并且可以進(jìn)一步改善花生烯四酸的代謝途徑。

綜上所述，基于UPLC-MS/MS檢測平臺(tái)的靶向代謝物，分析不同復(fù)合茶樣濃度下高脂血癥小鼠的代謝差異。從代謝組學(xué)的角度全面分析了代謝途徑及代謝產(chǎn)物的反應(yīng)，可以靈敏地刻畫出生命體發(fā)生的一系列的病理狀態(tài)變化。其最主要的特征就是篩選出潛在的治療高脂血癥的物質(zhì)，為研究復(fù)合茶對(duì)高脂血癥的降脂機(jī)理提供有價(jià)值的參考信息。