張弘弛，劉 瑞，巴德方，李 慧，楊 陽(yáng)，周 鳳

（山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 山西大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所, 山西大同 037009）

恒山黃芪，為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，主產(chǎn)于山西省大同市渾源縣，在廣靈縣、靈丘縣等地也有分布[1-3]。天然藥物研究證實(shí)，黃芪的主要藥效成分為皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)等，具有改善人體免疫系統(tǒng)，針對(duì)治療心腦血管疾病和腎臟疾病等的作用[4-6]。伴隨著恒山黃芪的市場(chǎng)占有率逐年提升，需要有明確的檢測(cè)方法，判斷恒山黃芪的質(zhì)量差異性?，F(xiàn)行的高效液相色譜技術(shù)（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）在評(píng)定中藥材的均一性和差異性時(shí)具有檢測(cè)靈敏度較高[7-9]的特點(diǎn)，但由于中藥材具有成分復(fù)雜、難分離特點(diǎn)，通過(guò)HPLC建立的指紋圖譜主要側(cè)重于中藥材的相似性評(píng)價(jià)，難以在差異性方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此需要一種兼顧相似性評(píng)價(jià)和差異性評(píng)價(jià)同時(shí)能快速檢測(cè)中藥材化學(xué)成分的方法。核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）技術(shù)具有分析速度快、無(wú)偏向性且對(duì)樣品依賴(lài)較少的特點(diǎn)[10-11]，適于分析中藥材的復(fù)雜成分，是對(duì)傳統(tǒng)方法的改良。而1H-NMR被應(yīng)用于天然藥物差異性和均一性的評(píng)價(jià)[12-15]，是因?yàn)橄鄬?duì)于高效液相指紋圖譜，氫核磁共振具有更高的靈敏性，更佳的分離性[16-17]，因而對(duì)天然藥物中低含量的藥用成分可做更詳細(xì)的定性和定量分析。同時(shí)該技術(shù)不需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，且對(duì)樣品要求低，可快速檢測(cè)天然藥物中不穩(wěn)定的化合物，成為了國(guó)內(nèi)外藥材評(píng)價(jià)的研究方法[18-21]。

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)，能有效壓縮數(shù)據(jù)，將分散的信息集合到主成分上，主成分是多個(gè)初變量按照不同權(quán)重合成的新變量，通過(guò)數(shù)據(jù)組合成新變量不僅可以描述數(shù)據(jù)集內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理[22-23]。通過(guò)1H-NMR技術(shù)測(cè)定天然藥物的氫核磁共振指紋圖譜，分析圖譜，可獲得多種有機(jī)化學(xué)成分的信息，同時(shí)結(jié)合PCA技術(shù)，可得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的綜合數(shù)據(jù)，再使用軟件分析數(shù)據(jù)，得到直觀圖形，可達(dá)到整體分析藥物化學(xué)成分的目的。

本研究采用超聲波復(fù)合酶法提取恒山黃芪化學(xué)成分，1H-NMR技術(shù)測(cè)定恒山黃芪的1H-NMR指紋圖譜，并進(jìn)行重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性考察，進(jìn)而對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行主成分評(píng)價(jià)。目的是通過(guò)該研究建立一種簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的恒山黃芪化學(xué)成分的評(píng)價(jià)方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

10批恒山黃芪 樣品的來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周鳳教授鑒定均為恒山黃芪（Astragalus membranaceus）；對(duì)比分析選用的甘肅黃芪和蒙古黃芪 均購(gòu)自于不同產(chǎn)區(qū)（見(jiàn)表1）；芒柄花苷、毛蕊異黃酮、黃芪皂苷 I、II、III 對(duì)照品，上海源葉生物科技有限公司（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）；芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷 對(duì)照品，成都瑞芬思生物科技有限公司（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）；氘代氯仿（CDCl3）上海吉至生化科技有限公司；纖維素酶（3 U/mg）和氏璧生物科技有限公司；果膠酶（30 U/mg） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；糖化酶（10 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司。

表1 恒山黃芪來(lái)源和年限Table 1 Source and age of Hengshan Astragalus membranaceus

Avance Ⅲ 500 MHz型核磁共振波譜儀 德國(guó)布魯克公司；THC-2B超聲波提取器 濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；XFB-2600小型粉碎機(jī) 吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；AXTGL16M微量臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海趙迪生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 恒山黃芪化學(xué)成分的提取

1.2.1.1 酶制劑的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取纖維素酶、果膠酶（質(zhì)量比1:1）共0.625 g，加少量去離子水，溶解后，定容于25 mL容量瓶中，制成25 mg/mL的復(fù)合酶制劑，備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取糖化酶0.625 g，加少量去離子水后定容于25 mL的容量瓶中，制成25 mg/mL的酶制劑，備用。

1.2.1.2 復(fù)合酶超聲提取 分別稱(chēng)取10個(gè)采樣地點(diǎn)的干燥粉碎的黃芪10 g于250 mL三角瓶中，加入復(fù)合酶制劑的量分別為2 mL復(fù)合酶和2 mL糖化酶溶液，加去離子水46 mL，調(diào)節(jié)pH緩沖體系至5.5，酶解40 min，溫度設(shè)置60 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速80 r/min，酶解完成后，添加50 mL無(wú)水甲醇，設(shè)置超聲條件：超聲功率為200 W，時(shí)間45 min，設(shè)置相同條件，重復(fù)提取一次，過(guò)濾合并濾液，90 ℃滅活30 s，減壓濃縮后，冷凍干燥。

1.2.21H-NMR的測(cè)定

1.2.2.1 核磁分析樣品的制備 取上述10 mg恒山黃芪提取物，加2 mL氘代氯仿，放入容量為5 mL的離心管中，設(shè)置離心條件：轉(zhuǎn)速為13000 r/min，時(shí)間為10 min，得上清液，將其轉(zhuǎn)至核磁管中，用于恒山黃芪化學(xué)成分的1H-NMR分析。

1.2.2.21H-NMR測(cè)定條件 測(cè)定溫度為25 ℃，1HNMR測(cè)定條件設(shè)置為：頻率500 MHz，掃描次數(shù)64次，譜寬為12345.7 Hz，傅里葉變換 0.188 Hz，脈沖間隔D1為1.0 s，延遲時(shí)間（RD）為1.0 s。手動(dòng)進(jìn)行相位、基線(xiàn)以及峰校正。采用 noesyppr1d 脈沖序列壓制水峰，內(nèi)標(biāo)為T(mén)SP。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 以3年恒山黃芪（編號(hào)Am-01）提取液為標(biāo)準(zhǔn)供試品溶液，在設(shè)定的1H-NMR條件下測(cè)定5次核磁圖譜，用MetreNova軟件處理圖譜，采用下述核磁數(shù)據(jù)分析方法，計(jì)算5組數(shù)據(jù)之間的相對(duì)峰面積積分值間的相關(guān)系數(shù)，分析儀器精密度。

1.2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取3年恒山黃芪（編號(hào)Am-01）提取液，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，在設(shè)定的1H-NMR條件下連續(xù)測(cè)定核磁圖譜，用MetreNova軟件處理圖譜，采用下述核磁數(shù)據(jù)分析方法，計(jì)算5組數(shù)據(jù)之間的相對(duì)峰面積積分值間的相關(guān)系數(shù)，分析實(shí)驗(yàn)重復(fù)性情況。

1.2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取3年恒山黃芪（編號(hào)Am-01）提取液，進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，溫度條件為25 ℃（即室溫條件），分別放置0、4、8、12、24 h后，在設(shè)定的1HNMR條件下分別測(cè)定核磁圖譜，用MetreNova軟件處理圖譜，采用下述核磁數(shù)據(jù)分析方法，計(jì)算5組數(shù)據(jù)之間的相對(duì)峰面積積分值間的相關(guān)系數(shù)，分析實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 核磁數(shù)據(jù)分析 將基于MestreNova 8.0分析處理得到的核磁指紋圖譜，對(duì)其進(jìn)行定標(biāo)、相位以及基線(xiàn)校正處理，以0.04 ppm為單位對(duì)圖譜進(jìn)行分段積分，位置區(qū)間為0～8.5 ppm，設(shè)置總峰面積為參照物，對(duì)其進(jìn)行歸一化處理，得到各化學(xué)位移段對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰面積值，分析處理得到的數(shù)據(jù)。在Excel軟件中分析處理積分得到的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.3.2 主成分分析 將上述不同來(lái)源的恒山黃芪樣品的1H-NMR數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析，進(jìn)一步評(píng)價(jià)恒山黃芪的化學(xué)成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

精密度實(shí)驗(yàn)中分段積分法計(jì)算相關(guān)系數(shù)結(jié)果分別為0.998、0.996、0.995、0.993和0.992，相關(guān)系數(shù)都大于0.99，證明儀器精密度高。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果分別為0.997、0.994、0.995、0.998和0.996，從5次相關(guān)系數(shù)都大于0.99，可以看出該提取方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果分別為0.994、0.995、0.996、0.992和0.993，從5次相關(guān)系數(shù)都大于0.99，可以看出在室溫條件下24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.2 恒山黃芪1H-NMR的典型信號(hào)歸屬

用于1H-NMR指紋圖譜研究的提取對(duì)象是混合體系，而非單體化合物，因而化合物的鑒定，會(huì)有其他成分的干擾，按照文獻(xiàn)[20]的報(bào)道，在氖代溶劑中加入一定pH范圍的緩沖鹽（本研究加入pH7.5的磷酸緩沖液），可以有效地緩解各成分化學(xué)位移值的漂移，從而降低成分間的干擾，提高NMR分析的準(zhǔn)確性。圖1為典型的恒山黃芪1H-NMR譜圖（500 MHz，CDCl3），采用“加標(biāo)準(zhǔn)品定性”實(shí)驗(yàn)進(jìn)行黃芪皂苷I、II、III、黃芪甲苷、芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷8種成分的1H-NMR信號(hào)歸屬。比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB（www.hmdb.ca）和BMRB（www.bmrb.wisc.edu）及相關(guān)文獻(xiàn)[1,24-27]進(jìn)行其余代謝次級(jí)代謝產(chǎn)物、氨基酸、糖類(lèi)等成分的1H-NMR 信號(hào)歸屬。結(jié)果，從恒山黃芪中共鑒定出了24種化合物，其中6個(gè)異黃酮類(lèi)化合物、7個(gè)皂苷類(lèi)化合物（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2）和其他11個(gè)初級(jí)代謝產(chǎn)物。

圖1 恒山黃芪特征1H-NMR信號(hào)峰Fig.1 Characteristic 1H-NMR signal peak of Hengshan Astragalus membranaceus medicinal materials

圖2 恒山黃芪中的皂苷和異黃酮Fig.2 Saponins and isoflavones in Hengshan Astragalus membranaceus

為了方便描述，將黃芪1H-NMR譜圖分為3個(gè)部分：黃酮類(lèi)成分（主要是芳香區(qū)域δ 5.0～9.0）、皂苷類(lèi)成分（主要是糖區(qū)域δ 2.0～5.0）、氨基酸類(lèi)成分（主要是脂肪區(qū)域δ 0.5～2.0），以下分別為3個(gè)區(qū)域核磁數(shù)據(jù)分析和化學(xué)信號(hào)歸屬。

黃酮類(lèi)成分：與芒柄花素的相似信號(hào)δ 3.78（s），6.86（d，2.0），6.96（2H，d，7.2），6.92（dd，2.0，8.8），7.48（2H，d，8.4）；與芒柄花苷相似的信號(hào)δ 3.81（s），7.26（s），5.10（d，7.2），7.01（d，8.5），7.16（d，1.5），7.54（d，8.5）；與毛蕊異黃酮相似的信號(hào)δ 3.78（s），7.04（s），6.84（d，2.4），7.94（d，8.8）；與毛蕊異黃酮苷相似的信號(hào)δ 3.78（s），6.94（s），7.04（s），5.05（d，5.2），6.84（d，2.4），6.91（d，2.4），7.94（d，8.8）；與3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷相似的信號(hào)δ 3.70（s），3.72（s），5.54（s），6.25（s），6.46（dd，8.0，8.4），6.96（d，8.0），7.28（d，8.4）；與9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷相似的信號(hào)δ 3.73（s），3.74（s），5.56（s），4.85（d，7.5），6.55（d，7.5），6.72（d，2.4），7.01（d，8.5），7.42（d，8.5）。

皂苷類(lèi)成分：恒山黃芪的核磁數(shù)據(jù)中與黃芪皂苷I相似的信號(hào)（化學(xué)位移、耦合常數(shù)、裂峰等），包括δ 0.93（s），1.27（s），1.30（s），1.42（s），1.60（s），1.79（s），1.97（s），2.03（s），2.52（d，8.0），3.14（dd，21.0，11.5），3.39（dd，11.5，4.5），3.80（ddd， 8.5，8.5，3.5），4.82（d，7.5），4.93（d，7.5）；與黃芪皂苷Ⅱ相似的信號(hào)δ 0.93（s），1.27（s），1.31（s），1.41（s），1.58（s），1.80（s），2.04（s），2.51（d，7.5），3.39（dd，11.0，4.0），3.76（ddd，10.0，9.0，3.0），3.88（dd，8.0，5.5），4.77（d，8.0），4.97（dd，14.2，7.2），4.90（d，7.5）；與黃芪皂苷III相似的信號(hào)δ 1.01（s），1.19（s），1.30（s），1.32（s），1.44（s），1.45（3 s），1.96（s），2.55（d，7.5），3.12（dd，21.4，11.0），3.57（dd，11.5，4.5），3.75（ddd，9.0，9.0，3.5），4.93（d，6.5），5.04（dd，14.0，7.0），5.42（d，7.5）；與黃芪甲苷相似的信號(hào)δ 0.95（s），1.30（s），1.38（s），1.42（s），1.59（s），2.06（s），2.53（d，9.0），3.14（dd，200，10.5），3.80（ddd，8.5，8.5，4.0），4.88（d，6.5），4.92（d，7.5）；與異黃芪苷I相似的信號(hào)δ 0.93（s），1.28（s），1.31（s），1.42（s），1.59（s），1.82（s），1.96（s），2.03（s），2.53（d，7.6），3.14（dd，21.0，10.6），3.78（ddd，9.0，9.0，3.8），3.89（dd，9.2，5.2），4.80（d，7.8），4.94（d，7.4），4.99（dd，14.8，7.2）；與異黃芪苷II相似的信號(hào)δ 1.02（s），1.11（s），1.28（s），1.30（s），1.36（s），1.48（s），1.50（s），2.00（s）；2.53（d，7.6），3.14（dd，21.0，10.6），3.39（dd，11.2，4.4），3.78（ddd，9.0，9.0，3.8），3.89（dd，9.2，5.2），4.80（d，7.8），4.94（d，7.4），4.99（dd，14.8，7.2）；與環(huán)黃芪醇相似的信號(hào)δ 1.03（s），1.30（s），1.33（s），1.37（s），1.45（s），1.58（s），1.89（s），1.96（dd，12.0，4.0），2.06（dd，11.5，9.0），2.55（d，7.5），3.12（dd，11.5，9.0），3.66（dd，11.5，4.5），3.80（d，9.5），3.89（dd，9.0，5.5）。

氨基酸類(lèi)成分：與甘氨酸相似的信號(hào)，包括δ 3.60（s）；與丙氨酸相似的信號(hào)，包括δ 1.49（d，7.2）；與纈氨酸相似的信號(hào)，包括δ 1.06（d，6.6），1.00（d，7.2）；與脯氨酸相似的信號(hào)，包括δ 2.08（m），2.36（m），4.16（dd，8.4，6.6）；與蘇氨酸相似的信號(hào)，包括δ 1.33（d，6.6），4.20（m）；與天冬酰胺相似的信號(hào)，包括δ 2.85（dd，7.8，16.8），2.95（dd，4.2，16.8），4.01（dd，7.8，4.2）；與蘋(píng)果酸相似的信號(hào)，包括δ 2.66（d，3.0），2.68（d，3.0）；與膽堿相似的信號(hào)，包括δ 3.21（s）；與尿苷相似的信號(hào)，包括δ 5.89（dd，4.2，7.2），7.93（d，7.8），3.85（dd，12.6，3.6）；與腺苷相似的信號(hào)，包括δ 6.03（d，6.6），8.23（s），8.35（s）；與蔗糖相似的信號(hào)，包括δ 4.03（t，8.4），4.18（d，9.0），5.40（d，4.2），3.44（t，8.4），3.82（m），3.53（dd，9.9，3.6），3.70（t，9.6）。

2.3 恒山黃芪典型1H-NMR指紋圖譜以及相似度分析

將10批恒山黃芪、3批蒙古黃芪和3批甘肅黃芪的1H-NMR測(cè)定數(shù)據(jù)導(dǎo)入MestReNova軟件，通過(guò)處理不同年限的恒山黃芪的積分面積，以相關(guān)系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，使用中值向量法計(jì)算得到10批恒山黃芪不同氫核磁共振指紋圖譜的共有模式R（圖3中對(duì)照?qǐng)D譜R）。通過(guò)分析其相同成分（1H-NMR中顯示相同信號(hào)），確定共有峰，并依據(jù)化學(xué)位移和耦合常數(shù)等，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，得到了10批恒山黃芪的1HNMR特征指紋圖譜（見(jiàn)圖3）。通過(guò)譜圖直觀分析，可以看到蒙古黃芪（赤峰、烏蘭察布、包頭）、甘肅黃芪（隴西、岷縣、渭源縣）、恒山黃芪（山西渾源）3個(gè)不同省份產(chǎn)的黃芪的提取物，其1H-NMR譜圖峰形以及化學(xué)位移、耦合常數(shù)等在高中低場(chǎng)區(qū)基本相同，證明3個(gè)不同省份產(chǎn)的黃芪都含有異黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、氨基酸類(lèi)等成分。但在部分場(chǎng)區(qū)仍有一定差異，如在低場(chǎng)區(qū)（δ 7.0～7.7），異黃酮的信號(hào)峰的強(qiáng)度存在著一定差異，恒山黃芪的信號(hào)峰強(qiáng)度明顯高于蒙古黃芪和甘肅黃芪，說(shuō)明恒山黃芪的異黃酮含量高于蒙古黃芪和甘肅黃芪。而在高場(chǎng)區(qū)（δ 0.8～2.0），恒山黃芪、蒙古黃芪、甘肅黃芪的信號(hào)峰數(shù)量以及峰形有一定的差別，表明它們的氨基酸、脂肪酸類(lèi)、以及部分糖基等有一定差別。

以共有模式R作為標(biāo)準(zhǔn)，在Excel軟件中計(jì)算三個(gè)不同產(chǎn)地以及不同年限的黃芪的相似度。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。從表中結(jié)果中可以看出，10批恒山黃芪的相識(shí)度都在0.9以上，而3批甘肅黃芪的相似度分別是0.774、0.753、0.761，3批蒙古黃芪的相似度分別是0.858、0.845、0.833。相識(shí)度分析結(jié)果與1H-NMR譜圖分析結(jié)果一致，說(shuō)明3個(gè)不同省份產(chǎn)的黃芪在化學(xué)成分上和含量上有明顯的差異性。10批恒山黃芪樣品的氫核磁共振指紋圖譜的平均相似度為0.975，結(jié)果表明不同年限恒山黃芪的1HNMR圖譜總體相似，差異較小，同時(shí)還可以看到，編號(hào)Am-02、Am-05、Am-06、Am-10恒山黃芪相較于其他年限的恒山黃芪相似度相對(duì)略低，表明這四批樣品相較于其他樣品存在一定差異。

表2 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Similarity evaluation result

2.4 主成分分析

2.4.1 貢獻(xiàn)率分析 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同鄉(xiāng)村產(chǎn)的恒山黃芪藥材的質(zhì)量差異性，將10批次樣品的恒山黃芪的1H-NMR數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析。數(shù)據(jù)采用中心化方法（Mean-centering and Not Scaling）進(jìn)行尺度同一化處理。通過(guò)主成分分析（見(jiàn)表3），可以看出恒山黃芪中的前4個(gè)主成分能夠預(yù)測(cè)95.5%的變量（圖4），R2X和Q2分別為0.955和0.629，對(duì)于變量具有良好的預(yù)測(cè)能力。主成分個(gè)數(shù)的提取原則為其對(duì)應(yīng)的特征值大于1，故取前3個(gè)作為主成分，其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到89.8%，它代表了所研究1H-NMR的89.8%的信息量。因?yàn)橄嗖钤酱螅暙I(xiàn)率越高，因而從圖4中看出，排在第一和第二的主成分對(duì)于變量，貢獻(xiàn)率分別為51.8%和20.6%，是恒山黃芪最重要的成分群，因此前兩個(gè)主成分能夠預(yù)測(cè)大部分的變量。

表3 抽取的主成分特征值及貢獻(xiàn)率Table 3 The characteristic value and contribution of principal components

圖4 恒山黃芪主成分貢獻(xiàn)率分析Fig.4 Analysis of contribution rate of the main components of Hengshan Astragalus membranaceus

由圖5主成分因子相關(guān)圖可以看出，前2個(gè)主成分因子與化學(xué)位移δ 0.98～1.72，1.84～2.44，2.80～3.12，3.88～4.16，5.36～6.76，7.08～7.32，7.76～7.96這六個(gè)分段峰內(nèi)特征峰高度正相關(guān)，說(shuō)明其對(duì)樣品的區(qū)分評(píng)價(jià)貢獻(xiàn)最大。而根據(jù)恒山黃芪1H-NMR的典型信 號(hào) 歸 屬 分 析，0.98～1.72，1.84～2.44，2.80～3.12，3.88～4.16分段，主要是三萜皂苷特征峰集中的區(qū)域，5.36～6.76，7.08～7.32，7.76～7.96分段，主要是異黃酮特征峰集中的區(qū)域，中國(guó)藥典中恒山黃芪的主要藥物化學(xué)成分也集中體現(xiàn)在這兩類(lèi)物質(zhì)中，而1H-NMR的PCA分析也證實(shí)了其與藥典的統(tǒng)一性，上述高度正相關(guān)的特征峰在恒山黃芪藥材的質(zhì)量控制中有相對(duì)重要的作用，而1H-NMR的快速分析也證實(shí)了其廣泛有效的應(yīng)用性。

圖5 主成分因子相關(guān)圖Fig.5 Principal component factor correlation graph

2.4.2 恒山黃芪的主成分分析 主成分分析研究結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，建立的1H-NMR指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法可用于恒山黃芪的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。主成分分析的二維得分圖和3D圖見(jiàn)圖6。圖6二維得分圖顯示，不同采樣地點(diǎn)的恒山黃芪數(shù)據(jù)點(diǎn)相互交錯(cuò)，均呈現(xiàn)出較松散的分布，樣品離散度相似且化學(xué)成分組呈現(xiàn)出一定的變異，然而，10批恒山黃芪在PCA分析聚為2類(lèi)（樣品Am-01、Am-02、Am-04、Am-05、Am-09聚為一類(lèi)，樣品Am-03、Am-06、Am-07、Am-08、Am-10聚為一類(lèi)），但聚類(lèi)分組不明顯，而樣品Am-02、Am-05、Am-06、Am-10距離中心點(diǎn)較遠(yuǎn)。圖6的3D圖顯示恒山黃芪較為集聚（Am-10遠(yuǎn)離群落，這與相似性分析結(jié)果一致），表明該組內(nèi)的均一性相對(duì)較好，在建立的三維坐標(biāo)圖中，不同來(lái)源的恒山黃芪集中在三維的位置，說(shuō)明10批的恒山黃芪樣品化學(xué)成分差異較小。綜合主成分分析說(shuō)明渾源縣不同地點(diǎn)生長(zhǎng)的恒山黃芪，雖然生長(zhǎng)環(huán)境有所不同，但在化學(xué)成分上不存在顯著差異，具有很強(qiáng)的相似性。

圖6 恒山黃芪主成分分析的分?jǐn)?shù)散點(diǎn)圖和3D圖Fig.6 Principal component analysis score scatter plot and 3D plot of Hengshan Astragalus membranaceus

對(duì)比分析Am-02、Am-05、Am-06、Am-10的采樣地點(diǎn)，可以得出恒山黃芪主要化學(xué)成分與其生態(tài)因子，特別是地區(qū)海拔有著密切關(guān)系。研究已經(jīng)證實(shí)，海拔高度和經(jīng)緯度是影響植物布局及其生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子，在一定范圍內(nèi)，海拔高度對(duì)植物化學(xué)成分有顯著影響[28-30]。恒山黃芪最適宜生長(zhǎng)的海拔高度為1400～1800 m[31]，而Am-02、Am-05、Am-06、Am-10的生長(zhǎng)海拔分別為1845、1910、1270和1856 m，并且從主成分3D圖可以看出Am-02、Am-05、Am-10的成分差異性更大，說(shuō)明恒山黃芪的主要化學(xué)成分隨海拔的增高而差異性變大。這一結(jié)果，也與胡明勛等[32]基于HPLC-DAD分析環(huán)境因素對(duì)黃芪的黃酮和皂苷類(lèi)成分的影響結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)不同來(lái)源恒山黃芪的相似度分析和主成分分析，發(fā)現(xiàn)渾源縣不同地方產(chǎn)的恒山黃芪化學(xué)成分不存在明顯差異性，建立了典型的恒山黃芪1H-NMR指紋圖譜，鑒別其存在24種化合物，包括三萜皂苷、異黃酮、氨基酸、有機(jī)酸、糖等，三萜主要有黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷III、黃芪甲苷、異黃芪苷I、異黃芪苷II、環(huán)黃芪醇；異黃酮主要有芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷。

現(xiàn)行的1H-NMR分離技術(shù)常用于對(duì)中藥材進(jìn)行系統(tǒng)生物分離后再進(jìn)行NMR分析，本研究未經(jīng)系統(tǒng)的生物分離過(guò)程，也達(dá)到了快速分析的目的，和高效液相圖譜分析相比，基于氫核磁共振的靈敏性可以更快速的更全面的顯示出恒山黃芪中的含量成分。為了更精密的測(cè)量恒山黃芪指紋圖譜中的信號(hào)，可進(jìn)一步采取將二維核磁共振（2D-NMR）圖譜與高分辨質(zhì)譜結(jié)合的方法，可對(duì)重疊信號(hào)進(jìn)行一定的分離并提供更多的結(jié)構(gòu)鑒定信息。

PCA相關(guān)分析結(jié)果表明，恒山黃芪的主要化學(xué)成分含量與海拔有一定的相關(guān)性，恒山黃芪作為山西地道藥材，其表現(xiàn)出的品質(zhì)優(yōu)勢(shì)是恒山地區(qū)多種環(huán)境因子決定的，是特定的氣候條件下，海拔、經(jīng)緯度、氣候、土壤的綜合影響的結(jié)果。而生態(tài)因子對(duì)藥材品質(zhì)的影響是多方位的，因此后續(xù)研究應(yīng)采用應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，同時(shí)分析不同生態(tài)因子相互作用的影響，進(jìn)一步分析生態(tài)因子對(duì)藥材化學(xué)成分代謝的關(guān)鍵酶。