李曉鵬,鄭 爽,劉塑杰,田京偉,杜廣營

(煙臺大學藥學院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺 264005)

免疫逃逸是指腫瘤通過多種機制逃避免疫系統(tǒng)的識別和攻擊,促進腫瘤細胞生長和轉移,是腫瘤存活和進展的重要策略[1-2]。吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO,EC1.13.11.42),是一種含亞鐵血紅素的酶,廣泛分布于人和其他哺乳動物除肝臟以外的組織中。IDO通過色氨酸在犬尿氨酸的分解代謝起關鍵作用[3],IDO可通過多種機制介導腫瘤免疫逃逸,已經(jīng)成為抗腫瘤免疫治療的新靶點。已經(jīng)有多個IDO抑制劑進入至臨床試驗階段,其中進展最快的BMS-986205(BMS公司)正在開展膀胱癌的phase 3研究[4-5]。然而,動物試驗研究結果顯示,IDO抑制劑單用時抗腫瘤作用較弱,腫瘤抑制率約30%～50%[6]。因此,有必要尋求提高IDO抑制劑臨床抗腫瘤作用的途徑,將IDO抑制劑與其他作用機制的抗腫瘤藥物如化療藥物聯(lián)合使用是其中重要策略之一。

紫杉醇是第一個應用于腫瘤化療的紫杉烷家族藥物,通過促進微管蛋白聚合抑制解聚,致使快速分裂的腫瘤細胞終止于有絲分裂G2M期而死亡,臨床上主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小細胞肺癌的一線和二線治療[7-9]。伊立替康及其活性代謝物SN-38可與拓撲異構酶I-DNA復合物結合,從而阻止斷裂單鏈的再連接,引起DNA雙鏈斷裂,主要用于成人轉移性大腸癌的治療[10]。力撲素是南京綠葉思科藥業(yè)公司生產的紫杉醇脂質體,臨床用于乳腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌的化療治療。氟尿嘧啶是以抗代謝物而起作用[11],在細胞內轉化為有效的氟尿嘧啶脫氧核苷酸后,通過阻斷脫氧核糖尿苷酸受細胞內胸苷酸合成酶轉化為胸苷酸,而干擾DNA的合成,臨床上廣泛用于多種腫瘤的化療治療如腸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等。

LPM3480226是山東綠葉制藥有限公司開發(fā)的小分子IDO抑制劑,結構式見圖1,正在中國開展臨床一期試驗,注冊登記號為CTR20182328。本研究以小鼠結腸癌CT26荷瘤小鼠為模型,觀察LPM3480226聯(lián)合紫杉醇、伊立替康、力撲素、氟尿嘧啶等常用化療藥物的抗腫瘤作用,為LPM3480226的開發(fā)以及臨床研究方案提供理論基礎和依據(jù)。

圖1 LPM3480226的化學結構式Fig.1 Chemical structure of LPM3480226

1 實驗材料

1.1 細胞株與動物

小鼠結腸癌細胞CT26. WT,由中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫提供,使用RPMI-1640培養(yǎng)基,含10%胎牛血清,于37 ℃,5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng),隔天換液1次,每2～3 d傳代,按1∶2～1∶5比例傳代。

BALB/c小鼠,雄性,體重16～20 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2014-0004,動物飼養(yǎng)于SPF級(無特定病原體)環(huán)境中,溫度21±2 ℃,濕度30%～70%,人工照明,晝夜12 h交替。所有動物相關的實驗操作均經(jīng)煙臺大學實驗動物倫理委員會審核并批準。

1.2 供試品與主要試劑

LPM3480226,白色或類白色粉末,山東綠葉制藥有限公司生產;HPLC純度大于99.7%,分子式為C12H12BrFN6O3S,相對分子質量為419.23。LPM3480226溶液配制:加入適量預先配制的20% Solutol溶液,50～60 ℃超聲至溶液澄清,再用溶劑定容至所需體積;配制成不同的濃度,配制后室溫遮光保存。

紫杉醇注射液,10 mL/60 mg/瓶,海口市制藥廠有限公司生產,用生理鹽水注射液稀釋至所需濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

注射液用紫杉醇脂質體(力撲素?),10 mL/30 mg/瓶,南京綠葉思科藥業(yè)有限公司生產,使用時向瓶內加入適量5%葡萄糖注射液,在紫杉醇脂質體專用振蕩器上振搖5 min,然后定容至所需體積,再稀釋至所需濃度,給藥前再振搖10 min。

注射用鹽酸伊立替康(開普拓?),2 mL/40 mg/瓶,輝瑞制藥生產,使用時吸取一定量原液,用生理鹽水注射液稀釋至所需濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

氟尿嘧啶注射液(海普?),10 mL/0.25 g/瓶,上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產,使用時吸取一定量原液,用生理鹽水注射液稀釋至所需濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

Kolliphor?HS15(Solutol)購自SIGMA公司,生理鹽水購自山東齊都藥業(yè)有限公司,葡萄糖注射液購自石家莊四藥有限公司,Matrigel@基質膠購自美國BD Biosciences公司。

2 實驗方法

2.1 CT26荷瘤小鼠制備

取對數(shù)生長期的CT26細胞,收集、重懸至無血清培養(yǎng)基中,調整細胞濃度為1×106個/mL,向細胞懸液中加入等體積的Matrigel,使細胞的終濃度為5×105個/mL。超凈工作臺中,于每只小鼠肩胛處皮下接種0.2 mL腫瘤細胞懸液,接種量為1×105個/只。待瘤快長至500～1000 mm3時,剝出瘤塊,剪刀剪碎,用皮埋植入穿刺針(直徑1.2 mm)接種至小鼠背部肩胛處皮下,制備CT26小鼠移植瘤模型。游標卡尺測量腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b),根據(jù)公式V=0.5×a×b2,計算腫瘤體積,待腫瘤體積長至100 mm3時,進行隨機分組,開始試驗。

2.2 劑量設計

前期荷瘤小鼠結腸癌CT26模型劑量依賴性研究結果顯示,LPM3480226在200 mg/kg時,腫瘤抑制作用最強,抑制率為40%左右。本實驗室藥效試驗研究背景資料顯示,紫杉醇、力撲素、氟尿嘧啶、伊立替康的最大耐受劑量分別約為20、40、40、50 mg/kg。因此,本實驗中,LPM3480226的給藥劑量設為200 mg/kg,每天2次灌胃給藥;紫杉醇、力撲素、氟尿嘧啶、伊立替康的給藥劑量分別設為20、40、40、50 mg/kg,每周2次靜脈注射給藥。

2.3 實驗分組與給藥

待瘤塊長至平均體積約100 mm3時開始分組,分組當天開始給藥,定義為第1天,本實驗共分為10個組,每組8只動物,給藥體積為0.1 mL/10 g,LPM3480226的給藥劑量設為200 mg/kg,每天2次灌胃給藥,紫杉醇、力撲素、氟尿嘧啶、伊立替康的給藥劑量分別設為20、40、40、50 mg/kg,每周2次靜脈注射給藥,連續(xù)給藥11 d,且停止給藥后繼續(xù)觀察小鼠的體重、腫瘤體積4 d,動物分組及給藥詳見表1。

表1 PM3480226聯(lián)合不同化療藥物抗小鼠CT26研究動物分組與給藥(n=8)Tab.1 Antitumor effect of combined LPM3480226 and chemotherapy drugs in CT26 carcinoma-bearing mice: grouping an administration (n=8)

2.4 觀察指標

2.4.1 動物體重及死亡 實驗期間每天觀察動物死亡,每2 d測量1次各組小鼠體重。實驗第15天,最后1次稱重,以分組時動物體重為基礎,計算體重變化百分率。

2.4.2 腫瘤體積 實驗期間,每2 d測量1次各組動物的腫瘤體積(V)。游標卡尺測量腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b),根據(jù)公式V=0.5×a×b2計算腫瘤體積。根據(jù)腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線,動態(tài)觀察受試藥物的抗腫瘤效應。

2.4.3 腫瘤重量 實驗第15天,小鼠經(jīng)脫頸椎實施安樂死,剝離瘤塊并稱重。根據(jù)腫瘤重量,計算每組的平均腫瘤重量MTV。相對腫瘤抑制率TGI(%):TGI=1-T/C。T/C為相對腫瘤增值率,即在某一時間點,治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和對照組瘤重。

參考文獻[12],依據(jù)腫瘤重量分別計算LPM3480226與紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶聯(lián)合指數(shù)CI=W聯(lián)合/(WLPM3480226×W(PTC/LPS/CPT/FU)),W聯(lián)合為LPM3480226+紫杉醇、LPM3480226+力撲素、LPM3480226+伊立替康、LPM3480226+氟尿嘧啶的平均瘤重與對照組平均瘤重的比值,WLPM3480226為LPM3480226單用組與對照組平均瘤重的比值,W(PTC/LPS/CPT/FU)為紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶單用組平均瘤重與對照組平均瘤重的比值。CI值<1表示有協(xié)同作用,CI值=1表示有相加作用,CI值> 1表示有拮抗作用。

2.5 統(tǒng)計分析

3 實驗結果

3.1 荷瘤小鼠動物體重

各給藥組均未出現(xiàn)動物死亡。體重結果如圖2和表2所示,實驗期間,LPM3480226組、紫杉醇組、力撲素組、伊立替康組動物體重在各時間點與對照組均無顯著差異(P>0.05);氟尿嘧啶組動物體重在第3至第7天顯著低于對照組(P<0.05);LPM3480226+紫杉醇組在第5至第9天,LPM3480226+力撲素組在第7至第13天,LPM3480226+伊立替康組在第5、9、13天,LPM3480226+氟尿嘧啶組在第5至第13天,動物體重顯著低于對照組(P<0.05),這些組別在這些時間點的動物體重降低幅度不大,多小于10%。第11天最后一次給藥結束后,各給藥組動物體重開始恢復,至實驗結束時(第15天),各給藥組和對照組的動物平均體重和分組時的自身體重相比變化不大(-0.5%～6%)。

LPM3480226經(jīng)灌胃給藥,200 mg/kg,BID。四種化療藥物均經(jīng)靜脈給藥,BIW。給藥后每2 d測量1次動物體重,數(shù)據(jù)以表示(n=8);*P<0.05,與對照組比較。圖2 LPM3480226聯(lián)合不同化療藥物對CT26荷瘤小鼠體重的影響Fig.2 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on body weight of CT26-bearing mice

表2 LPM3480226聯(lián)合不同化療藥物對CT26荷瘤小鼠體重及瘤重的影響(n=8)Tab.2 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on body weight and CT26 xenografts (n=8)

3.2 腫瘤體積

各組腫瘤生長曲線如圖3所示,LPM3480226組在給藥后第5天開始腫瘤體積顯著小于對照組(P<0.05);紫杉醇組、力撲素組在給藥后第5天開始,伊立替康組、氟尿嘧啶組在給藥后第3天開始,腫瘤體積均顯著小于對照組(P<0.05);LPM3480226+紫杉醇組、LPM3480226+力撲素組、LPM3480226+伊立替康組在給藥后第5天開始,LPM3480226+氟尿嘧啶組在藥后第3天開始,腫瘤體積均顯著小于對照組(P<0.05)。在實驗后期(第13至第15天),LPM3480226+力撲素、LPM3480226+伊立替康和LPM3480226+氟尿嘧啶各組動物的平均腫瘤體積均小于LPM3480226單用組(P<0.05),同時也小于化療藥單用組(P<0.05),而LPM3480226+紫杉醇的腫瘤體積與單用組無顯著差異(P>0.05)。

LPM3480226經(jīng)灌胃給藥,200 mg/kg,BID。四種化療藥物均經(jīng)靜脈給藥,BIW。給藥后每2天測量1次腫瘤體積,數(shù)據(jù)以表示(n=8)。*P<0.05,和對照組比較;#P<0.05,與LPM3480226組比較;@P<0.05,與力樸素組比較;&P<0.05,與伊立替康組比較;＄P<0.05,與氟尿嘧啶組比較。圖3 LPM3480226聯(lián)合不同化療藥物對CT26移植瘤體積的影響Fig.3 Effects of combinantion LPM3480226 and different chemotherapy drugs on CT26 tumor volume

3.3 腫瘤重量及抑制率

實驗結束時,各給藥組的平均腫瘤重量均顯著小于對照組(P<0.05)(圖4)。LPM3480226+紫杉醇組腫瘤重量顯著小于LPM3480226組(P<0.05),但與紫杉醇組相比較不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05),腫瘤重量抑制率分別為54.1% vs 30.6%和42.3%。LPM3480226+伊立替康組、LPM3480226+氟尿嘧啶組、LPM3480226+力撲素組的腫瘤重量均顯著小于LPM3480226組(P<0.05),同時也顯著小于相應化療藥物單用組(P<0.05)。LPM3480226+力撲素組、LPM3480226+伊立替康組、LPM3480226+氟尿嘧啶組腫瘤重量與相應化療藥物單用組的抑制率分別為61.5% vs 38.8%,55.1% vs 36.8%, 78.8 % vs 53.6%,抑制率提高20%以上。根據(jù)腫瘤重量計算LPM3480226和紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶的CI值分別為1.14、0.90、1.02、0.66,其中力樸素和氟尿嘧啶的CI值小于1,且力樸素和氟尿嘧啶聯(lián)用組腫瘤重量顯著小于單用組,提示LPM3480226和力樸素、氟尿嘧啶聯(lián)用具有一定協(xié)同效應。

LPM3480226,灌胃給藥,200 mg/kg,BID;紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶靜脈給藥,給藥劑量分別為20、40、50、40 mg/kg,BIW。數(shù)據(jù)以表示(n=8)。*P<0.05,與對照組比較;#P<0.05,與LPM3480226組比較;@P<0.05,與力撲素組比較;&P<0.05,與伊立替康組比較;＄P<0.05,與氟尿嘧啶組比較。圖4 LPM3480226聯(lián)合不同化療藥物對CT26移植瘤重量的影響Fig.4 Effects of combination of LPM3480226 and different chemotherapy drugs on CT26 tumor weight

4 討論與結論

臨床前研究結果顯示,IDO抑制劑能有效提升PD-1等免疫檢查點藥物的抗腫瘤作用,已經(jīng)成為腫瘤聯(lián)合用藥研究的主流方向[13],但IDO抑制劑與化療藥物的聯(lián)合使用未見系統(tǒng)報道。本研究采用CT26荷瘤小鼠模型考察了IDO抑制劑LPM3480226聯(lián)合紫杉醇、力撲素、伊立替康、氟尿嘧啶等常用化療藥物的抗腫瘤作用。LPM3480226與各化療藥物聯(lián)用時,對荷瘤小鼠體重影響較小,提示出聯(lián)合用藥具有較好的耐受性;LPM3480226可不同程度地顯著增強紫杉醇、伊立替康、力撲素、氟尿嘧啶等化療藥物的抗腫瘤作用。LPM3480226與不同化療藥物聯(lián)用的抗腫瘤增強作用機制并不明確,推測可能機制如下:抗癌藥物可誘導癌細胞凋亡,有利于淋巴細胞浸潤,同時釋放更多腫瘤抗原,可增強IDO抑制劑對T細胞的活化作用,改善腫瘤免疫微環(huán)境,上述因素協(xié)同作用,產生較強的抗腫瘤活性。

綜上,LPM3480226與化療藥物紫杉醇、力撲素、伊立替康以及氟尿嘧啶聯(lián)用時具有較好的耐受性,可提高化療藥物的抗腫瘤作用,支持在臨床試驗中進一步考察LPM3480226與上述化療藥物聯(lián)用的抗腫瘤作用。