劉 歡,沙春潔,邵 馨,劉萬卉,

(1. 煙臺大學(xué)藥學(xué)院，分子藥理和藥物評價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺大學(xué))，新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 煙臺，264005；2.山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264003)

納武利尤單抗(百時(shí)美施貴寶,Nivolumab)是一種全人源化IgG4單克隆抗體,它可以選擇性地與PD-1結(jié)合并阻止PD-1和PD-L1或PD-L2之間在腫瘤上的相互作用,從而防止T細(xì)胞衰竭;還可以使已經(jīng)衰竭的T細(xì)胞重新激活,發(fā)揮免疫作用,殺死腫瘤細(xì)胞,從而減緩或阻止腫瘤生長,以達(dá)到治療目的[1]。該藥于2015年在美國獲批用于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),現(xiàn)已獲批用于15個(gè)適應(yīng)癥、8個(gè)瘤種的治療。 為評估藥物在受試者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征,需定量檢測各時(shí)間點(diǎn)采集的血清樣本中的藥物濃度。目前抗體藥物定量檢測的首選方法是配體結(jié)合法(Ligand binding assay, LBA)[2],此類方法中的酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)因成本低、操作簡單、通量高而最為常用。ELISA是酶催化底物顯色,通過測定特定波長下顯色底物吸光度來進(jìn)行定量的方法,而酶催化底物從開始顯色到顯色飽和的濃度范圍較窄,所以此方法檢測范圍較窄，對于高濃度的血漿樣品往往需要多步稀釋,操作繁瑣。因此，為了減少樣品處理時(shí)間,有必要建立一種檢測范圍比ELISA更寬的方法。

時(shí)間分辨熒光免疫檢測技術(shù)(Time-resolved fluorescence immunoassay, TRFIA)是基于鑭系螯合物(Eu, Sm, Tb, Dy)發(fā)出的熒光來檢測待測物的免疫分析法,鑭系元素的熒光壽命遠(yuǎn)高于血清樣本中存在的熒光物質(zhì),可在本底熒光衰變后檢測鑭系元素的熒光信號,從而降低熒光物質(zhì)的干擾[3]。信號響應(yīng)隨熒光標(biāo)記物濃度增大而增大的范圍寬,因此檢測范圍也更寬。目前TRFIA較多地應(yīng)用于細(xì)胞因子、生物標(biāo)志物、蛋白、多肽等的檢測[4-7]?；谂潴w結(jié)合原理,標(biāo)記有鑭系元素的二抗與藥物結(jié)合也能實(shí)現(xiàn)對抗體藥物的定量檢測。本實(shí)驗(yàn)建立了基于TRFIA法檢測食蟹猴血清中抗體藥納武利尤的方法,對其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果符合中國藥典對生物樣品檢測的要求。對食蟹猴靜脈給藥納武利尤單抗的血清樣本進(jìn)行檢測,并與經(jīng)過驗(yàn)證的ELISA方法進(jìn)行了比較。

1 材 料

1.1 動(dòng)物

體重3.0～5.0 kg的雄性食蟹猴3只[來自廣州相觀生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2018-0043,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號:SYXK(鄂)2016-0090]?？瞻资承泛飩€(gè)體血清(北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。

本試驗(yàn)涉及的動(dòng)物福利均遵循湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司動(dòng)物福利指導(dǎo)原則(指導(dǎo)原則編號:GAW 018-2018)。研究提交實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)(IACUC)審核和批準(zhǔn)。試驗(yàn)期間動(dòng)物管理和使用遵循美國National Academy Press出版的《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》(2011)、國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)2017年修訂的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。本試驗(yàn)所涉及的動(dòng)物管理、使用和相關(guān)操作均經(jīng)過湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn),批準(zhǔn)文號:IACUC(準(zhǔn))-2019-076。

1.2 試劑耗材

供試藥物:納武利尤單抗(Opdivo,批號:ABA8488,百時(shí)美施貴寶公司); 生物素標(biāo)記藥物: Biotin-opdivo (山東博安生物技術(shù)有限公司進(jìn)行生物素標(biāo)記);Eu標(biāo)記的山羊抗人 IgG 抗體、解離增強(qiáng)液、低熒光96孔板均來自于PerkinElmer;PD-1蛋白(R&D systerm);高吸附96孔板(Thermo);TMB(sigma);HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體(SouternBiotech)。

1.3 儀器

酶標(biāo)儀(型號:SpectraMaxM5e,來源:Molecular Devices),微孔板恒溫振蕩器(型號:PHMP-4,來源:Grant bio),洗板機(jī)(型號:405LS,來源:BioTeK)。

2 方 法

2.1 TRFIA方法的建立

參照已有的ELISA方法,選擇間接TRFIA法作為檢測方式。實(shí)驗(yàn)步驟為:PD-1蛋白100 μL/孔包板,4 ℃靜置過夜,次日用1% BSA封閉,37 ℃振蕩孵育1 h,洗板后上樣,樣品100 μL/孔,37 ℃振蕩孵育1 h,加入Eu標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體,100μL/孔,孵育1 h;洗板后加解離增強(qiáng)液,200 μL/孔,室溫振蕩15 min,讀取時(shí)間分辨熒光,采用四參數(shù)回歸方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品濃度。對讀板條件、PD-1蛋白包板質(zhì)量濃度、Eu標(biāo)記的山羊抗人 IgG 抗體質(zhì)量濃度進(jìn)行摸索。

2.2 ELISA方法

微孔板包被PD-1蛋白,4 ℃靜置過夜,次日用1% BSA封閉,37 ℃振蕩孵育1 h,洗板后上樣,37 ℃振蕩孵育1 h,加入HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體,孵育1 h;洗板后加TMB,100 μL/孔,室溫避光反應(yīng)25 min,1 mol/L磷酸終止,讀板。

2.3 TRFIA方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)2020版中國藥典生物樣品定量分析指導(dǎo)原則項(xiàng)下配體結(jié)合分析[8]進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

食蟹猴靜脈推注單次給藥,劑量為3 mg/kg,給藥體積0.3 mL/kg,在給藥肢體的對側(cè)前肢或后肢皮下靜脈取血,血樣采集時(shí)間點(diǎn):給藥前(0 h),給藥開始后0.25 h(15 min)、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h(D 2)、72 h(D 4)、168 h(D 8)、240 h(D 11)、336 h(D 15)、504 h(D 22)。收集全血至采集管中,待血液凝結(jié)后2～8 ℃離心,3500 r/min,離心10 min,分離血清,放置于-80 ℃超低溫冰箱凍存待測。

2.5 樣品檢測

分別用TRFIA和ELISA方法對食蟹猴血清樣品進(jìn)行檢測,并比較兩組數(shù)據(jù)的差異。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 WinNolin(8.1)軟件的非房室模型法(NCA)對藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。利用 Micro-soft Excel(2010)計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 方法優(yōu)化結(jié)果

3.1.1 熒光條件選擇 Eu3+螯合物通常在615 nm處有最大發(fā)射光[9],讀取激發(fā)光為250～450 nm,發(fā)射光為615 nm的熒光,得到圖1所示的激發(fā)光譜,由圖1可知 Eu3+螯合物在激發(fā)波長為340 nm,發(fā)射波長為615 nm條件下有最強(qiáng)的熒光信號,因此選擇此條件進(jìn)行檢測。

圖1 Eu3+螯合物激發(fā)光譜Fig.1 Eu3+ chelate excitation Spectrum

3.1.2 時(shí)間分辨條件選擇 考察在不同時(shí)間分辨條件下對本底熒光的消除情況,結(jié)果如表1所示,沒有經(jīng)過時(shí)間延遲,猴血清和空白板有很強(qiáng)的熒光信號,200 μs過后,本底熒光很小,對檢測幾乎沒有影響。但Eu3+螯合物仍有很強(qiáng)的熒光信號。

表1 時(shí)間分辨設(shè)置Tab.1 TRF setting

3.1.3 捕獲抗原質(zhì)量濃度的選擇 PD-1蛋白用PBS配制成0.5、1、2、4、10 μg·mL-1,100 μL/孔包板,4 ℃靜置過夜,次日封閉后加入高濃度的納武利尤單抗,37 ℃振蕩孵育1 h,加入Eu標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體,100 μL/孔,孵育1 h;洗板后加解離增強(qiáng)液,200 μL/孔,室溫振蕩15 min,在激發(fā)光340 nm,發(fā)射光615 nm波長下讀取經(jīng)200 μs延遲至1 000 μs的熒光。由包板質(zhì)量濃度-熒光積分值曲線(圖2)可知，當(dāng)包板質(zhì)量濃度大于2 μg·mL-1時(shí),熒光計(jì)數(shù)趨于飽和,因此2 μg·mL-1的PD-1為最佳包板質(zhì)量濃度。

圖2 不同PD-1包板質(zhì)量濃度下的結(jié)合曲線Fig.2 Binding curves at different PD-1 coating concentrations.

3.1.4 不同Eu3+-山羊抗人IgG抗體質(zhì)量濃度的選擇 考察PD-1包板質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1,納武利尤單抗 100 ng·mL-1條件下不同質(zhì)量濃度標(biāo)記二抗特異性/非特異性響應(yīng)信號值,結(jié)果如圖3所示,檢測抗體質(zhì)量濃度為100 ng·mL-1時(shí),特異性/非特異性信號比最高,因此選擇100 ng·mL-1的銪標(biāo)記山羊抗人IgG抗體進(jìn)行檢測。

圖3 不同Eu3+-山羊抗人IgG質(zhì)量濃度的特異性和非特異性結(jié)合曲線Fig.3 Specific and non-specific binding curves at different Eu3+-goat anti-human IgG concentrations

3.1.5 優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)流程 2 μg·mL-1PD-1蛋白100 μL/孔包板,4 ℃靜置過夜,次日用1% BSA封閉,37 ℃振蕩孵育1 h,洗板后上樣,標(biāo)曲質(zhì)控用空白食蟹猴血清配制,與待測樣品在上樣前用0.1% BSA/PBST溶液稀釋,100 μL/孔上樣,37 ℃振蕩孵育1 h,加入100 ng·mL-1Eu標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體,100 μL/孔,孵育1 h;洗板后加解離增強(qiáng)液,200 μL/孔,室溫振蕩15 min,讀取激發(fā)波長為340 nm,發(fā)射波長為615 nm,200～1 000 μs時(shí)間分辨熒光積分值。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍 對標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度樣品(2 500、625、156.25、39.06、9.77、2 ng·mL-1)進(jìn)行檢測,所得的熒光強(qiáng)度積分值與質(zhì)量濃度值GraphPad軟件經(jīng)過四參數(shù)擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=(A-D)/(1+x/C)B,A=2 244,B=0.922,C=113.9,D=2.74,R2=1.000 0,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。方法的定量范圍為2～2 500 ng·mL-1,靈敏度為2 ng·mL-1。

圖4 納武單抗的四參數(shù)校正曲線Fig.4 Calibration curve of nivolumab detection

3.2.2 精密度和準(zhǔn)確度 連續(xù)3天共評價(jià)了6批質(zhì)控樣品,每批包含1套標(biāo)準(zhǔn)曲線(2 500、625、156.25、39.06、9.77、2 ng·mL-1),5套質(zhì)控樣品(2 500、2 000、300、5、2 ng·mL-1)。各質(zhì)量濃度標(biāo)曲、質(zhì)控樣品用空白食蟹猴血清配制,上樣前用0.1% BSA/PBST稀釋液稀釋50倍。批內(nèi)批間準(zhǔn)確度均值應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi),對于定量下限和定量上限,應(yīng)在標(biāo)示值的±25%范圍內(nèi)。批內(nèi)批間變異系數(shù)一般不得超過20%,定量上下限的變異系數(shù)不得超過25%。精密度準(zhǔn)確度結(jié)果見表2。定量上限、定量下限的批內(nèi)精密度在 3.6%～14.2%范圍內(nèi),批間精密度在10.0%～10.6%范圍內(nèi)。低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控的批內(nèi)精密度在 1.2%～16.5%內(nèi),批間精密度在 9.6%～12.2%范圍內(nèi)。定量上下限的準(zhǔn)確度在-14.3%～11.9%。低中高質(zhì)量濃度質(zhì)控準(zhǔn)確度在-14.3%～11.4%范圍內(nèi)。符合中國藥典要求。

表2 方法精密度與準(zhǔn)確度(n=6)Tab.2 Precision and accuracy of method(n=6)

3.2.3 穩(wěn)定性 考察高、低兩個(gè)質(zhì)量濃度水平的質(zhì)控樣品(2 000、5 ng·mL-1)在實(shí)驗(yàn)臺上穩(wěn)定性(樣品預(yù)處理后室溫放置4 h,室溫放置12 h)、長期穩(wěn)定性(-80 ℃凍存1個(gè)月)以及反復(fù)凍融穩(wěn)定性(3個(gè)周期),每個(gè)考察條件的高、低質(zhì)量濃度樣品各三份。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,結(jié)果表明,各個(gè)考察條件的質(zhì)控樣品回算質(zhì)量濃度的回收率在理論質(zhì)量濃度的92.1%～101.5%范圍內(nèi),精密度在7.0～18.8%內(nèi),滿足中國藥典接受標(biāo)準(zhǔn)。

表3 納武利尤單抗在食蟹猴血清中的穩(wěn)定性Tab.3 Stability of nivolumab in cynomolus monkey serum

3.2.4 選擇性 選擇10個(gè)空白個(gè)體血清進(jìn)行選擇性考察。10個(gè)個(gè)體的空白樣品均不能檢測到納武利尤單抗,LLOQ回收率在理論質(zhì)量濃度的80.2%～118.9%范圍內(nèi),說明基質(zhì)中存在的非相關(guān)物質(zhì)對檢測沒有干擾。

3.2.5 稀釋線性和鉤狀效應(yīng) 對150 000、30 000、3 000、600 ng·mL-1的納武利尤單抗食蟹猴血清樣本用空白食蟹猴血清稀釋后進(jìn)行檢測,回收率在82.5%～111.9%,精密度在2.8%～15.1%,表明不同的稀釋倍數(shù)不影響檢測的準(zhǔn)確性。對上述樣品不經(jīng)空白食蟹猴血清稀釋檢測,熒光讀數(shù)隨濃度增加而增加,說明在600～10 000 ng·mL-1范圍內(nèi)無鉤狀效應(yīng)。

3.2.6 樣品檢測結(jié)果 通過TRFIA和ELISA兩種方法檢測對來自3只食蟹猴的33個(gè)血清樣本獲得的藥時(shí)曲線圖見圖5;用 WinNolin(8.1)軟件的非房室模型法(NCA)對藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表4。TRFIA和ELISA兩種方法測得的藥時(shí)曲線趨勢相似,兩種方法所測數(shù)據(jù)用 Micro-soft Excel(2010)進(jìn)行單因素方差分析,P>0.05,說明兩種方法所測數(shù)據(jù)間無顯著性差異。對TRFIA與ELISA檢測來自3只動(dòng)物的33個(gè)血清樣本結(jié)果進(jìn)行線性擬合,擬合的曲線見圖6,得到的線性回歸方程為y=0.986 85x+1.286 42(R2=0.941 73),表明兩種方法相關(guān)性良好。

圖5 TRFIA、ELISA兩種方法測得納武利尤單抗在食蟹猴體內(nèi)的藥時(shí)曲線Fig.5 plasma concentration-time profiles of nivolumab in cynomolgus monkey determined by TRFIA and ELISA

表4 TRFIA和ELISA檢測食蟹猴血清中納武利尤單抗的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of plasma from cynomolgus monkeys based on drug-concentration of nivolumab,as determined by TRFIA and ELISA

圖6 TRFIA、ELISA兩種方法測得測得納武利尤單抗質(zhì)量之間的線性關(guān)系Fig.6 Linear correlation between the nivolumab concentration determined by TRFIA and ELISA

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立了TRFIA法檢測納武利尤單抗在食蟹猴血清中濃度的方法,對間接TRFIA法的熒光條件、時(shí)間分辨條件、捕獲抗原質(zhì)量濃度、檢測二抗質(zhì)量濃度進(jìn)行了比較,確定了最佳讀板條件為激發(fā)波長340 nm,發(fā)射波長615 nm,在時(shí)間分辨模式下讀取200～1000 μs熒光,最佳包板質(zhì)量濃度為2 μg/mL,最佳Eu標(biāo)記山羊抗人IgG抗體質(zhì)量濃度為100 ng·mL-1。對該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果符合中國藥典對生物分析方法的要求。PLUIM D等[10]開發(fā)的ELISA法檢測人血清和腦脊液中納武利尤單抗,檢測范圍為2～100 ng·mL-1。本實(shí)驗(yàn)建立的TRFIA方法與ELISA法相比,靈敏度相當(dāng),但檢測范圍更寬,檢測范圍為2～2 500 ng·mL-1,是ELISA法的25倍。對于食蟹猴血漿樣品,兩種方法檢測結(jié)果間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與其他配體結(jié)合法相比,TRFIA沒有放射性免疫法的放射性污染的缺點(diǎn)[11];試劑耗材價(jià)格遠(yuǎn)低于電化學(xué)發(fā)光法(ECL);線性范圍比ELISA寬,因此TRFIA有望在抗體藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究中有更廣的應(yīng)用。