胡榮蓉，丁世杰，郭赟，朱浩哲，陳益春，劉政，丁希，唐長(zhǎng)波，周光宏

Trolox對(duì)豬肌肉干細(xì)胞增殖及分化的影響

胡榮蓉，丁世杰，郭赟，朱浩哲，陳益春，劉政，丁希，唐長(zhǎng)波，周光宏

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；南京 210095

【目的】探究抗氧化劑-水溶性維生素E的類似物（Trolox）通過(guò)調(diào)控活性氧對(duì)豬肌肉干細(xì)胞增殖及分化過(guò)程產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)肉種子細(xì)胞在體外增殖及分化過(guò)程提供研究基礎(chǔ)?！痉椒ā渴紫仍谪i肌肉干細(xì)胞增殖過(guò)程中，添加不同濃度（0、50、100和200 μmol?L-1）的Trolox培養(yǎng)3 d，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞增殖倍數(shù)，同時(shí)利用CCK8技術(shù)檢測(cè)不同濃度的Trolox對(duì)細(xì)胞增殖的影響；利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度Trolox處理后表征干性的表達(dá)水平，Western Blotting技術(shù)檢測(cè)PAX7蛋白的表達(dá)水平；通過(guò)CellROX熒光染料對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧進(jìn)行染色并通過(guò)高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)檢測(cè)Trolox對(duì)活性氧的調(diào)控作用；進(jìn)一步在豬肌肉干細(xì)胞體外成肌分化進(jìn)程中添加Trolox處理，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)分化早期標(biāo)志基因、及終末分化標(biāo)志基因肌球蛋白重鏈（）的表達(dá)水平，并利用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)MyHC蛋白的表達(dá)，利用免疫熒光技術(shù)對(duì)MyHC進(jìn)行染色并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞比例?！窘Y(jié)果】細(xì)胞增殖倍數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，50和100 μmol?L-1的Trolox處理組豬肌肉干細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著高于對(duì)照組（<0.05）；CCK8測(cè)得50和100 μmol?L-1Trolox處理組第3天的吸光值顯著高于對(duì)照組（<0.05）；100和200 μmol?L-1的Trolox顯著上調(diào)了的表達(dá)（<0.05），對(duì)PAX7蛋白的表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異（>0.05）；添加Trolox后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平被極顯著降低（<0.001）；在分化進(jìn)程中添加Trolox后，預(yù)分化階段的和及終末分化階段的均顯著上調(diào)（<0.05），而Western blotting結(jié)果顯示MyHC蛋白的表達(dá)無(wú)顯著變化（>0.05）；免疫熒光結(jié)果顯示陽(yáng)性細(xì)胞比例有增多的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異（>0.05）?！窘Y(jié)論】Trolox通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧，促進(jìn)豬肌肉干細(xì)胞的增殖以及分化進(jìn)程。

Trolox；豬肌肉干細(xì)胞；活性氧；增殖；分化

0 引言

【研究意義】細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)作為一項(xiàng)高效、環(huán)保、可持續(xù)的新型肉類生產(chǎn)方式，近年來(lái)逐漸成為研究熱點(diǎn)[1-3]。目前，肌肉干細(xì)胞是培養(yǎng)肉生產(chǎn)中最具有潛力的種子細(xì)胞。通過(guò)體外分離與培養(yǎng)，肌肉干細(xì)胞定向分化形成多核肌細(xì)胞，并表達(dá)肌肉特有的肌球蛋白重鏈，形成肌肉纖維組織[4-5]。然而隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，肌肉干細(xì)胞的增殖及分化能力出現(xiàn)明顯下降[6-8]，從而影響培養(yǎng)肉的生產(chǎn)效率?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，干細(xì)胞增殖與分化的過(guò)程受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原狀態(tài)及培養(yǎng)環(huán)境等因素的影響[9-13]，其中氧化還原狀態(tài)對(duì)干細(xì)胞增殖及分化的影響尤為重要[14-15]。細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)主要由活性氧的產(chǎn)生及抗氧化系統(tǒng)對(duì)其的清除來(lái)調(diào)控，因此，活性氧水平在一定程度上可以表示細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)[16-17]。干細(xì)胞退出靜息狀態(tài)進(jìn)入增殖、分化的進(jìn)程，主要的代謝方式會(huì)發(fā)生從糖酵解到氧化磷酸化的轉(zhuǎn)換，同時(shí)伴隨著活性氧產(chǎn)生的增加[18-19]。然而，過(guò)量的活性氧會(huì)造成干細(xì)胞功能受損，Gu等[20]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)積累過(guò)量的活性氧導(dǎo)致細(xì)胞增殖及分化能力衰退；而L'HONORE等[21]也發(fā)現(xiàn)在小鼠的肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中，持續(xù)升高的活性氧抑制了細(xì)胞增殖，并作為信號(hào)分子誘導(dǎo)肌肉干細(xì)胞的分化；MALINSKA等[22]在C2C12小鼠肌肉細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)活性氧的升高誘導(dǎo)細(xì)胞從增殖進(jìn)入分化進(jìn)程。Trolox是水溶性維生素E的類似物，其作為一種標(biāo)準(zhǔn)的抗氧化劑，能夠減少細(xì)胞的氧化損傷，如HORN等[23]研究發(fā)現(xiàn)Trolox能夠抑制間充質(zhì)干細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的凋亡及炎癥發(fā)生；此外，多數(shù)研究表明，Trolox可直接通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的活性氧從而影響細(xì)胞的生理功能；例如FROTA JUNIOR等[24]發(fā)現(xiàn)Trolox通過(guò)降低活性氧提高神經(jīng)細(xì)胞在體外的細(xì)胞活力并促進(jìn)神經(jīng)突生成?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期研究提示活性氧對(duì)干細(xì)胞增殖及分化的影響因劑量水平及細(xì)胞類型等的不同而存在差異[25]；目前活性氧對(duì)肌肉干細(xì)胞增殖及分化影響的研究主要集中在小鼠肌肉干細(xì)胞上，關(guān)于豬等畜禽類動(dòng)物領(lǐng)域的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)抗氧化劑—Trolox對(duì)豬肌肉干細(xì)胞內(nèi)的活性氧進(jìn)行調(diào)控，研究Trolox對(duì)豬肌肉干細(xì)胞體外增殖及分化過(guò)程的影響，進(jìn)一步探討活性氧對(duì)豬肌肉干細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控作用，從而為培養(yǎng)肉的規(guī)模化生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 七日齡幼豬，由蘇食集團(tuán)生豬養(yǎng)殖基地提供。

1.1.2 主要試劑 澳洲胎牛血清、Ham’s F-10營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、bFGF、磷酸鹽緩沖溶液（PBS），購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；100×青霉素鏈霉素雙抗、0.25%胰酶，購(gòu)于上海貝博生物公司；CellROX? Deep Red試劑，購(gòu)于英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；Trolox，購(gòu)于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；RIPA裂解液（強(qiáng)），購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；Trizol總RNA提取試劑，購(gòu)于英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；TB Green? Premix Ex Taq? II、PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time，均購(gòu)于日本Takara公司；Tris-MOPS-SDS電泳緩沖液、免疫印跡PVDF膜，購(gòu)于南京金斯瑞生物科技有限公司；PAX7一抗（貨號(hào)：PAX7），購(gòu)于DSHB公司；MyHC一抗（貨號(hào)：ab37484），購(gòu)于Abcam公司；GAPDH一抗（貨號(hào)：MAB374），購(gòu)于Millipore公司；鼠二抗（貨號(hào)：CW2333S），購(gòu)于Cwbiotech公司；CCK-8 Kit，購(gòu)于南京木林森生物科技有限公司；免疫熒光鼠二抗（貨號(hào)：A11005），購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬肌肉干細(xì)胞體外短期培養(yǎng) 以七日齡幼豬P5代的肌肉干細(xì)胞為研究對(duì)象，按照1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種到直徑為10 cm且底部鋪有膠原的培養(yǎng)皿中，首先在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），生長(zhǎng)因子與培養(yǎng)基的添加比例為1﹕2 000；再添加提前通過(guò)DMSO配制好的0、50、100和200 mmol?L-1的Trolox，Trolox與培養(yǎng)基的添加比例為1﹕1 000（Trolox終濃度為0、50、100和200 μmol?L-1），2 d換一次液。培養(yǎng)3 d后去除原培養(yǎng)基，用4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去殘留的原培養(yǎng)基，然后通過(guò)0.25%的胰酶將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，收集細(xì)胞后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.2 CCK8檢測(cè)豬肌肉干細(xì)胞增殖情況 將P5代豬肌肉干細(xì)胞以1×104/mL接到96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，試驗(yàn)組培養(yǎng)基含有50、100和200 μmol?L-1的Trolox，對(duì)照組不含Trolox，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2和3 d，每隔24 h，加入10 μL的CCK8試劑，在培養(yǎng)箱中孵育1 h，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。

1.2.3 豬肌肉干細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的測(cè)定 參照L'honore等[21]的方法，將細(xì)胞以1×104/mL接到96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，分別培養(yǎng)1、2、3和4 d，試驗(yàn)組培養(yǎng)基含有100 μmol?L-1的Trolox，對(duì)照組不含Trolox；然后進(jìn)行CellROX染色；CellROX染色具體操作步驟為：吸去細(xì)胞原培養(yǎng)基，更換添加含有CellROX Deep Red試劑的新鮮培養(yǎng)基，CellROX Deep Red試劑與培養(yǎng)基的配制比為1﹕500；將細(xì)胞放置在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱孵育30 min；吸去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，更換添加含有Hoechst試劑的新鮮培養(yǎng)基，Hoechst與培養(yǎng)基的配制比為1﹕1 000；將細(xì)胞置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱孵育5 min；吸去培養(yǎng)基，PBS清洗3次；添加100 μL新鮮培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，在活細(xì)胞狀態(tài)下進(jìn)行高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量 收集狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入Trizol試劑裂解細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA；按照天根RNA試劑盒的操作技術(shù)說(shuō)明書(shū)提取RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度；通過(guò)TAKARA的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)測(cè)定，按照操作技術(shù)說(shuō)明書(shū)展開(kāi)操作，RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，循環(huán)40次，然后繪制曲線。使用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因在不同cDNA模板中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 使用RIPA裂解細(xì)胞并提取總蛋白，通過(guò)BCA法測(cè)定總蛋白的濃度；加入Loading Buffer在95℃下進(jìn)行蛋白變性；取適量的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印結(jié)束后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉1.5 h；4℃下孵育一抗14—16 h（PAX7終濃度為0.5 μg?mL-1，MyHC的稀釋比例為1﹕1 000）、二抗孵育2 h（稀釋比例為1﹕2 000）；顯影拍照；使用Quantity one軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析。

1.2.6 免疫熒光鑒定肌管的形成 細(xì)胞分化結(jié)束后吸去分化培養(yǎng)基，PBS清洗1遍，用4%多聚甲醛（PFA）固定，并在4℃下過(guò)夜；然后用0.5% Triton X-100通透30 min，PBS清洗3遍；加入一抗（MyHC的稀釋比為1﹕800）在4℃下孵育過(guò)夜，PBS清洗3遍；然后加入二抗（稀釋比例為1﹕500）在室溫下孵育1 h，PBS清洗3遍；滴加含DAPI的防熒光猝滅劑，蓋上合適的蓋玻片，在玻片周圍滴加指甲油封片，在共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用GraphPAD Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用One-way ANOVA、檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。每組試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少采集3個(gè)技術(shù)重復(fù)或視野。

表1 RT-qPCR引物信息

2 結(jié)果

2.1 豬肌肉干細(xì)胞體外短期培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察短期培養(yǎng)1、2和3 d的豬肌肉干細(xì)胞，培養(yǎng)1 d的細(xì)胞主要發(fā)生貼壁過(guò)程，細(xì)胞數(shù)量少、體積小，細(xì)胞形態(tài)呈球形或偏梭形；隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞體積開(kāi)始變大且形態(tài)趨于穩(wěn)定，主要呈長(zhǎng)梭形或者紡錘形，呈典型肌肉干細(xì)胞形態(tài)（圖1）。

2.2 Trolox對(duì)豬肌肉干細(xì)胞體外增殖的影響

從倒置顯微鏡觀察，Trolox處理組的細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組更多，細(xì)胞體積略?。▓D2-A—D）。細(xì)胞增殖倍數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示（圖2-E），較對(duì)照組，50、100和200 μmol?L-1的Trolox處理組分別增殖了1.26倍、1.22倍、1.07倍，其中50和100 μmol?L-1的Trolox處理組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著高于對(duì)照組（<0.05）。進(jìn)一步通過(guò)CCK8法檢測(cè)Trolox對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示（圖2-F），50和100 μmol?L-1的Trolox處理組3 d的吸光值顯著高于對(duì)照組（<0.05）。綜上，Trolox對(duì)豬肌肉干細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，且適宜的促增殖濃度為50和100 μmol?L-1。

A—C：培養(yǎng)1、2、3 d的豬肌肉干細(xì)胞（50×）；D—F：培養(yǎng)1、2、3 d的豬肌肉干細(xì)胞（200×）

A—D：分別為0、50、100和200 μmol?L-1的Trolox培養(yǎng)3 d后的豬肌肉干細(xì)胞（50×）；E：不同濃度的Trolox培養(yǎng)3 d后豬肌肉干細(xì)胞的增殖倍數(shù)；F：CCK8法檢測(cè)不同濃度的Trolox培養(yǎng)1、2和3 d豬肌肉干細(xì)胞的增殖情況

2.3 Trolox對(duì)豬肌肉干細(xì)胞內(nèi)活性氧的調(diào)控

檢測(cè)Trolox對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響，探究Trolox是否通過(guò)發(fā)揮其抗氧化特性—降低活性氧[26-27]，從而促進(jìn)豬肌肉干細(xì)胞的增殖。通過(guò)CellROX熒光染料對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧染色以及高通量高內(nèi)涵活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果顯示，在豬肌肉干細(xì)胞短期培養(yǎng)過(guò)程中（1—3 d為正常短期增殖時(shí)期，第4天為細(xì)胞增殖至長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，即預(yù)備分化的階段），Trolox處理組單個(gè)細(xì)胞CellROX染色的單位面積平均熒光強(qiáng)度（圖3-C）、熒光染色面積（圖3-D）顯著低于對(duì)照組（<0.05），最后通過(guò)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞CellROX染色的總熒光強(qiáng)度，顯示Trolox處理組每個(gè)細(xì)胞CellROX染色的總熒光強(qiáng)度被極顯著降低（圖3-E）（<0.001），表明Trolox處理后，細(xì)胞內(nèi)的活性氧被顯著降低。以上結(jié)果進(jìn)一步表明降低體外培養(yǎng)過(guò)程中豬肌肉干細(xì)胞內(nèi)的活性氧能夠促進(jìn)其增殖，說(shuō)明活性氧對(duì)豬肌肉干細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。

2.4 Trolox對(duì)豬肌肉干細(xì)胞干性基因PAX7的影響

培養(yǎng)肉的生產(chǎn)需要在體外獲得大量的肌肉干細(xì)胞，同時(shí)要求其具有較高的分化潛能，肌肉干細(xì)胞的增殖能力以及分化潛能表征著其“干性”，PAX7是衡量肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)干性水平的重要指標(biāo)[28-29]。RT-qPCR以及蛋白免疫印跡技術(shù)對(duì)PAX7的檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平（圖4-A），Trolox處理組的表達(dá)量隨Trolox濃度升高而升高，其中100和200 μmol?L-1的Trolox處理組的表達(dá)量分別顯著上調(diào)了65%（<0.05）和111.6%（<0.01）；而100和200 μmol?L-1的Trolox處理組PAX7蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組有上調(diào)的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異（圖4-B）。結(jié)果表明Trolox在一定程度上能夠維持豬肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)的干性。

圖4 不同濃度的Trolox對(duì)PAX7的影響

2.5 Trolox對(duì)豬肌肉干細(xì)胞分化的影響

體外培養(yǎng)豬肌肉干細(xì)胞（圖5-A），使其增殖4 d至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿、細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)為肌肉干細(xì)胞的預(yù)分化階段（圖5-B），隨即更換分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞分化5 d，至70%的細(xì)胞融合形成多核肌管，即終末分化結(jié)束（圖5-C）。

選用對(duì)豬肌肉干細(xì)胞促增殖作用及對(duì)干性基因上調(diào)作用較明顯的100 μmol?L-1Trolox進(jìn)行分化進(jìn)程試驗(yàn)。是早期標(biāo)志生肌分化調(diào)控因子，能夠推進(jìn)肌肉干細(xì)胞肌源性分化進(jìn)程并啟動(dòng)肌源性祖細(xì)胞的終末分化[30]；是標(biāo)志肌細(xì)胞融合的基因，其表達(dá)量隨著肌細(xì)胞融合數(shù)量的增加而增加[31]。通過(guò)RT-qPCR技術(shù)對(duì)預(yù)分化階段和表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示（圖5-D—E），Trolox處理組、的表達(dá)顯著上調(diào)，較對(duì)照組分別顯著上調(diào)145.7%、87.4%（<0.05）。

肌球蛋白重鏈標(biāo)志著肌肉干細(xì)胞終末分化階段多核肌管的形成，通過(guò)RT-qPCR以及蛋白免疫印跡技術(shù)對(duì)的檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平（圖5-F），無(wú)論是在增殖時(shí)期還是進(jìn)入分化的過(guò)程添加Trolox，對(duì)的表達(dá)都有顯著上調(diào)作用，其中在增殖及分化兩個(gè)過(guò)程都添加Trolox的處理組上調(diào)最顯著，較對(duì)照組顯著上調(diào)了81.5%（=0.0003），而只在增殖階段以及只在分化階段添加Trolox的處理組分別顯著上調(diào)33.1%（<0.01）、31.0%（<0.05）；然而在翻譯水平（圖5-G），與對(duì)照組相比，Trolox對(duì)MyHC蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響；通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)肌管進(jìn)行染色（圖5-H—K），統(tǒng)計(jì)肌管中的細(xì)胞核占樣品中總細(xì)胞核的比例，其可以表征肌細(xì)胞融合指數(shù)[6]，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（圖5-L），Trolox處理后，MyHC陽(yáng)性細(xì)胞比例有增多的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，Trolox能夠促進(jìn)豬肌肉干細(xì)胞的分化進(jìn)程。

3 討論

迄今為止，肌肉干細(xì)胞對(duì)肌肉再生及肥大的貢獻(xiàn)已被大量研究證實(shí)，肌肉干細(xì)胞從靜息狀態(tài)被激活，在體外進(jìn)行增殖、分化的過(guò)程很好地模擬了肌肉纖維組織的發(fā)育途徑，因此，近年來(lái)，肌肉干細(xì)胞又被作為最具有潛力的種子細(xì)胞用于培養(yǎng)肉技術(shù)的研究?；钚匝跏钦{(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的主要氧化活性物質(zhì)，參與調(diào)控干細(xì)胞的增殖及分化過(guò)程。研究表明，降低體外培養(yǎng)的干細(xì)胞活性氧水平，有助于干細(xì)胞的體外擴(kuò)增；例如BAI等[32]通過(guò)使用可降解的兩性離子水凝膠構(gòu)建體外3D培養(yǎng)環(huán)境幫助造血干細(xì)胞維持細(xì)胞內(nèi)較低的活性氧水平，從而顯著提高了細(xì)胞的擴(kuò)增能力；此外，還可以通過(guò)添加抗氧化物質(zhì)來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的活性氧。唐朝春[33]通過(guò)使用多酚類抗氧化物質(zhì)—白藜蘆醇促進(jìn)了造血干細(xì)胞的體外增殖；在肌肉干細(xì)胞的研究中，L'HONORE等[21]通過(guò)抗氧化劑—N-乙酰半胱氨酸（NAC）或Trolox處理降低小鼠肌肉干細(xì)胞內(nèi)的活性氧來(lái)改善細(xì)胞增殖能力的衰退；GARCíA- PRAT等[26]同樣通過(guò)使用Trolox抑制細(xì)胞內(nèi)過(guò)高的活性氧從而恢復(fù)老年小鼠肌肉干細(xì)胞的功能特性并增強(qiáng)其用于肌肉組織的修復(fù)能力。本研究結(jié)果表明Trolox降低增殖過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，促進(jìn)了豬肌肉干細(xì)胞增殖，與L'HONORE等[21]和GARCíA-PRAT等[26]的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，豬肌肉干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的活性氧對(duì)其增殖具有一定的抑制作用?；钚匝鯇?duì)干細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)功能性的生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等進(jìn)行了氧化修飾?；钚匝跻鸬难趸揎椏梢苑譃閮煞矫妫环矫嫱ㄟ^(guò)氧化修飾直接或間接地激活某些信號(hào)通路從而改變細(xì)胞命運(yùn)，例如在小鼠肌肉干細(xì)胞中，活性氧通過(guò)氧化磷酸化激活P38 MAPK信號(hào)通路，促使其退出細(xì)胞周期，提前進(jìn)入分化進(jìn)程[21]；另一方面是造成細(xì)胞損傷，例如DNA或RNA鏈的斷裂，以及蛋白質(zhì)氧化造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化甚至使其失去活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能受損、衰退，如氧化后的肌肉干細(xì)胞會(huì)發(fā)生DNA損傷以及不可逆性衰老[26]，在間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)由于活性氧的累積造成細(xì)胞周期停滯并且促使細(xì)胞衰老、凋亡[20]。關(guān)于豬肌肉干細(xì)胞體外短期培養(yǎng)過(guò)程中，活性氧對(duì)其增殖的具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

肌肉干細(xì)胞的干性主要表現(xiàn)為其增殖能力及分化潛能，PAX7是肌肉干細(xì)胞的特異性核轉(zhuǎn)錄因子，也是目前公認(rèn)的衡量肌肉干細(xì)胞干性的標(biāo)志物。有研究表明，PAX7通過(guò)抑制初級(jí)分化基因的表達(dá)以及誘導(dǎo)有絲分裂的一部分肌肉干細(xì)胞回到靜息狀態(tài)來(lái)維持干性；抑制PAX7的表達(dá)，肌肉干細(xì)胞則無(wú)法維持干細(xì)胞池且只能走向分化[34]。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，高表達(dá)7的肌肉干細(xì)胞被賦予高水平的干性，它們?cè)隗w外可持續(xù)增殖并具備分化成多核肌管的潛能。本研究中，Trolox能夠顯著上調(diào)的表達(dá)，且在翻譯水平對(duì)PAX7蛋白的表達(dá)也有上調(diào)趨勢(shì)，表明Trolox在一定程度上能夠維持豬肌肉干細(xì)胞體外培養(yǎng)的干性，與L'HONORE等[21]在小鼠肌肉干細(xì)胞中的研究結(jié)果類似，這可能與活性氧參與調(diào)控肌肉干細(xì)胞干性相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。例如有研究表明，達(dá)到一定水平的活性氧可以激活P38 MAPK通路，而P38α信號(hào)通路在肌肉干細(xì)胞從增殖到分化的進(jìn)程中起非常重要的作用[35-36]，激活的p38α信號(hào)通路可以通過(guò)上調(diào)JNK磷酸酶MKT-1關(guān)閉JNK促增殖通路導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的下調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞退出細(xì)胞周期[37]；此外，p38α信號(hào)通路還可以通過(guò)磷酸化Ezh2促進(jìn)YY1和PRC2之間的相互作用，在PAX7啟動(dòng)子上形成抑制性染色質(zhì)，從而下調(diào)肌肉干細(xì)胞中的表達(dá)[38-39]；因此，推測(cè)抗氧化劑Trolox可能是通過(guò)降低活性氧，抑制了P38 α等信號(hào)通路的活化，從而維持肌肉干細(xì)胞的干性。

MALINSKA等[22]發(fā)現(xiàn)小鼠C2C12肌肉細(xì)胞系在分化開(kāi)始前活性氧劇烈升高；L'HONORE等[21]通過(guò)抗氧化劑抑制小鼠肌肉干細(xì)胞預(yù)分化時(shí)期的活性氧，阻止了細(xì)胞進(jìn)入分化進(jìn)程。這些研究表明，達(dá)到一定水平的活性氧是誘導(dǎo)肌肉干細(xì)胞分化的信號(hào)分子。本研究發(fā)現(xiàn)，在豬肌肉干細(xì)胞體外短期培養(yǎng)過(guò)程中，活性氧水平隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸下降，且在預(yù)分化階段活性氧水平未出現(xiàn)升高的現(xiàn)象；同時(shí)，通過(guò)在豬肌肉干細(xì)胞分化進(jìn)程中添加抗氧化劑Trolox處理后發(fā)現(xiàn)，分化早期標(biāo)志基因和、終末分化的標(biāo)志基因都顯著上調(diào)，并且免疫熒光結(jié)果顯示陽(yáng)性細(xì)胞比例增大，表明抗氧化劑Trolox能夠促進(jìn)豬肌肉干細(xì)胞的分化進(jìn)程；這與MALINSKA等[22]和L'HONORE等[21]在小鼠肌肉干細(xì)胞中的研究結(jié)果相反，可能是因?yàn)閬?lái)源于不同類型的動(dòng)物肌肉干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程存在生物學(xué)差異。此外，本研究中Trolox顯著上調(diào)的表達(dá)，而對(duì)MyHC蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，并且同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在對(duì)的檢測(cè)結(jié)果中，推測(cè)可能與mRNA在合成蛋白前后受到轉(zhuǎn)錄及翻譯后調(diào)控的過(guò)程有關(guān)，mRNA在翻譯成蛋白之前需要經(jīng)歷一系列轉(zhuǎn)錄后修飾和加工等過(guò)程，且真核生物的轉(zhuǎn)錄以及翻譯過(guò)程存在時(shí)間和空間上的有序性[40]，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白的合成滯后；另外，蛋白合成之后同樣受到翻譯后調(diào)控的過(guò)程，當(dāng)?shù)鞍追€(wěn)定性不好時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)的更新速度加快，多合成出來(lái)的蛋白很快會(huì)被降解[41]，因此也可能導(dǎo)致蛋白的變化未能被檢測(cè)出來(lái)。根據(jù)本研究結(jié)果，推測(cè)豬肌肉干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的活性氧對(duì)其成肌分化的過(guò)程可能存在負(fù)調(diào)控作用。活性氧對(duì)肌肉干細(xì)胞成肌分化的負(fù)調(diào)控作用可以通過(guò)激活某些信號(hào)通路從而導(dǎo)致肌源性分化的轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)，例如目前研究較多的NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為與骨骼肌分化的負(fù)調(diào)控直接相關(guān)；ARDITE等[42]和GUTTRIDGE等[43]通過(guò)外源性氧化應(yīng)激導(dǎo)致小鼠肌肉干細(xì)胞內(nèi)活性氧升高，升高的活性氧激活NF-κB信號(hào)通路，從而直接下調(diào)肌源性生肌分化因子的表達(dá)，的下調(diào)進(jìn)一步會(huì)抑制成肌調(diào)節(jié)因子和的表達(dá)，最終造成成肌分化受損。另有研究表明NF-κB信號(hào)通路還可以通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白cyclin D1促進(jìn)有絲分裂阻止肌肉干細(xì)胞進(jìn)入分化進(jìn)程[44]。此外，當(dāng)活性氧處于異常高水平時(shí)，對(duì)細(xì)胞造成的氧化損傷也會(huì)導(dǎo)致肌肉干細(xì)胞分化能力的降低，例如在體外突變胚胎肌細(xì)胞中氧化還原控制的核心調(diào)節(jié)因子Pitx2/3，造成調(diào)節(jié)線粒體功能的核呼吸因子下調(diào)，從而引起產(chǎn)生的活性氧劇烈升高，過(guò)量的活性氧導(dǎo)致成肌細(xì)胞DNA氧化損傷的積累以及成肌分化細(xì)胞的凋亡[45]。以上所述研究均是在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的情況下進(jìn)行的，而本研究中豬肌肉干細(xì)胞處于正常生理狀態(tài)，未來(lái)可以通過(guò)建立豬肌肉干細(xì)胞的氧化模型來(lái)探究活性氧對(duì)細(xì)胞分化的具體調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

抗氧化劑Trolox可通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平促進(jìn)豬肌肉干細(xì)胞的增殖以及成肌分化進(jìn)程，且能夠維持細(xì)胞的干性；研究結(jié)果為未來(lái)通過(guò)調(diào)控活性氧優(yōu)化培養(yǎng)肉種子細(xì)胞在體外增殖及分化的過(guò)程提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Effects of Trolox on Proliferation and Differentiation of Pig Muscle Stem Cells

Hu RongRong, Ding ShiJie, Guo Yun, ZHU HaoZhe, CHEN YiChun, LIU Zheng, DING Xi, TANG ChangBo, ZHOU GuangHong

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University/National Meat Quality and Safety Control Engineering Technology Research Center/Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing 210095

【Objective】The objective of this study was to investigate the regulatory effects of Trolox, an antioxidant water-soluble vitamin E analogue, on the proliferation and differentiation of pig muscle stem cells, which possibly was affected by reactive oxygen species. The study could provide a theoretical fundament for further optimizing the proliferation and differentiation process of cultured meat seed cells.【Method】Initially, 0, 50, 100 and 200 μmol·L-1of Trolox was added to pig muscle stem cells during their proliferation culture for 3 d, respectively. The blood cell counter and CCK8 technology were both used to detect the influence of Trolox on the cell proliferation. RT-qPCR was employed to measure the expression level of PAX7 gene for the further characterizing cellular stemness induced by Trolox. Meanwhile, Western Blotting was also used to testify the expression level of PAX7 protein. The intracellular reactive oxygen species was stained by CellROX fluorescent dye, and the High-throughput High-content Live Cell Confocal Imaging System was adopted to evidence the regulatory effect of Trolox on reactive oxygen species. Trolox was additionally used to themyogenic differentiation of pig muscle stem cells. RT-qPCR was used to detect the expression levels of early differentiation marker genes,and terminal differentiation marker gene myosin heavy chain (). Western Blotting was applied to detect the expression of MyHC protein, whereas Immunofluorescence technique stained MyHC and counted the proportion of MyHC positive cells.【Result】The cell proliferation fold statistics indicated that the proliferation fold of pig muscle stem cells in 50 or 100 μmol·L-1Trolox treatment groups was significantly higher than that under the control group (<0.05); CCK8 test showed that the absorbance value under 50 or 100 μmol·L-1Trolox treatment groups on the 3rd day was significantly higher than that under the controls (<0.05); Trolox concentrations at 100 or 200 μmol·L-1significantly up-regulated the expression of PAX7 gene (<0.05), but had no dominant effect for the improvement of PAX7 proteins with no statistical difference (>0.05). The level of reactive oxygen species in the cells was significantly reduced (<0.001) when Trolox applied. Moreover, after the addition of Trolox to the cells in their differentiation process, MYOG and CAV-3 in the predifferentiation stage as well as MyHC genes in the terminal differentiation stage were dramatically up-regulated (<0.05). However, Western Blotting results exhibited that the expression of MyHC protein had no a huge change (>0.05), while the immunofluorescence results displayed that the proportion of MyHC positive cells had an increasing trend but there was no statistical difference (>0.05).【Conclusion】Trolox promoted the proliferation and differentiation of pig muscle stem cells via reducing reactive oxygen species in the cells.

Trolox; pig muscle stem cells; reactive oxygen species; proliferation; differentiation

2021-05-20；

2021-07-31

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31501509）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃政府間國(guó)際科技創(chuàng)新合作項(xiàng)目（2019YFE0103800）、江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目青年創(chuàng)新基金（80900604）

胡榮蓉，E-mail：1119776527@qq.com。丁世杰，E-mail：shijieding@njau.edu.cn。胡榮蓉與丁世杰為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者唐長(zhǎng)波，E-mail：changbotang@hotmail.com。通信作者周光宏，E-mail：guanghong.zhou@hotmail.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）