黃勝，梁華英，龐偉鴻，葉曉云，陳亞珍

(湛江中心人民醫(yī)院檢驗科，廣東 湛江 524037)

0 引言

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，文獻(xiàn)報道顯示，2015年宮頸癌新發(fā)病例9.89萬，死亡3.05萬[1]，嚴(yán)重危害女性的生命健康，而宮頸惡性病變的直接病因是高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染[2]，高危因素有早婚或人工流產(chǎn)次數(shù)、過早性生活或性伴侶數(shù)多、衛(wèi)生習(xí)慣差、宮頸腫瘤家族史、精神創(chuàng)傷、 吸煙、性傳播疾病及免疫抑制等，HPV感染具有地域性和多樣性[3]，了解不同地區(qū)女性群體中 HPV 基因型分布情況和對宮頸惡性病變的“歸因”程度，對于宮頸癌預(yù)防具有重要意義。本文通過對湛江地區(qū)HPV基因型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，了解湛江地區(qū)HPV 基因型的分布情況，為湛江地區(qū)宮頸癌的預(yù)防和篩查提供有價值的參考數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

對2012年1月至2020年12月間到我院就診的52771女性取宮頸分泌物進(jìn)行HPV檢測，年齡19-70歲，平均(42±3.6)歲。

1.2 儀器及試劑

采用核酸分子快速雜交基因分型檢測系統(tǒng)，DA7600PCR擴(kuò)增儀(廣州達(dá)安)，HHM-21型醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(廣東凱普)，基因組抽提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒及雜交試劑盒由廣東凱普生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 宮頸脫落細(xì)胞的采集

先用棉拭子將陰道及宮頸口過多的分泌物輕輕擦拭干凈，再用試劑盒提供的專用宮頸刷插入子宮頸外口，順時針或逆時針轉(zhuǎn)動5圈采集宮頸脫落細(xì)胞，然后將其放入含專用細(xì)胞保存液的試管中，4℃冰箱保存。

1.3.2 DNA提取與擴(kuò)增

吸取500μL細(xì)胞懸液標(biāo)本，14000r/min離心1min，棄去上清液，然后按試劑盒的DNA提取步驟抽提DNA。取1μLDNA抽提液，加入HPV擴(kuò)增體系，采用擴(kuò)增儀擴(kuò)增，95℃預(yù)變性10min，95℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸45s，擴(kuò)增40個循環(huán)，最后72℃延伸5min，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物立即雜交發(fā)型或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 分子雜交分型

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物95℃變性5min，立即放入冰盒2min，與1mL預(yù)熱至45℃的雜交緩沖液混合，在導(dǎo)流雜交儀上45℃孵育10min后導(dǎo)流雜交，加入封阻液封閉，酶標(biāo)，沖洗，顯色，在30min內(nèi)查看分析結(jié)果，每次實驗必須具備反應(yīng)質(zhì)控點，雜交顯色質(zhì)控點，陽性對照點顯色，陰性對照點不顯色，表示同時在控，實驗結(jié)果有效。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2012-2020年HPV感染率結(jié)果

見表1。

表1 2012-2020年HPV感染率一覽表

2012-2016年HPV感染率年平均43.68%，2017-2020年HPV感染率年平均25.06%，兩者有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 14239例HPV感染亞型分布

見表2。

表2 14237例HPV感染亞型分布(單位：%)

3 討論

宮頸癌是目前世界女性第2常見的惡性疾病，僅次于乳腺癌，盡早篩查、及時發(fā)現(xiàn)和適當(dāng)治療是防治宮頸癌、降低疾病死亡風(fēng)險的重要手段。隨著HPV亞型與官頸癌發(fā)病相關(guān)性研究的深入，HPV分型檢測在官頸癌篩查中的地位愈顯重要，HPV分型檢測作為初篩方案，因其高敏感性、高陰性預(yù)測值而適于大樣本人群篩查，但特異性稍低。

HPV是一種雙鏈環(huán)狀無包膜的DNA病毒，通過黏膜或皮膚傳染，具有親嗜性。根據(jù)基因序列的不同，目前已確定的HPV亞型有200余種，超過40種HPV亞型可感染肛門、生殖道和其他部位的上皮和黏膜，而導(dǎo)致女性宮頸癌的關(guān)鍵因素為高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染；HPV感染分低危型和高危型感染，前者是導(dǎo)致尖銳濕疣或?qū)m頸癌前病變的危險因素，后者是導(dǎo)致宮頸癌的直接原因，18種高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83)和5種低危型HPV(HPV6、11、42、43、81)。2012年美國陰道鏡和子宮頸病理協(xié)會制定宮頸癌篩查指南將高危型HPV檢測和宮頸細(xì)胞學(xué)共同納入篩查體系，2015年提出將HPV檢測作為初篩宮頸癌的策略。隨著對HPV研究的不斷深入，HPV主要致病亞型在不同宮頸病變中的作用逐漸明確。高危型HPV持續(xù)感染是官頸癌發(fā)生發(fā)展的最主要因素，其中約60%官頸癌與HPV16/18感染相關(guān)。高危型HPV感染可以產(chǎn)生病毒癌蛋白并通過一系列分子機(jī)制致使細(xì)胞周期失控發(fā)生永生化，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。HPV持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸局部微環(huán)境變化，隨之而來的是免疫抑制、細(xì)胞增殖、血管形成及組織分化等，這一系列過程中任何調(diào)控因子的改變均可能會引起宮頸細(xì)胞的癌變。研究表明，預(yù)防HPV感染可以有效預(yù)防宮頸癌的發(fā)生[4-5]。

本文調(diào)查結(jié)果顯示，湛江地區(qū)2012-2020年間HPV檢測篩查陽性率30.0%，高于曹杰賢等[6]報道的云南7個地區(qū)的HPV陽性率16.07%，低于廊坊地區(qū)篩查的38.42%的HPV感染率[7]。丁雪晴等[8]報道的泰州地區(qū)陽性率為25.57%，本研究結(jié)果與之相近。田斌等[9]報道的安徽銅陵地區(qū)宮頸炎女性HPV檢出率為35.3%，這些差異存在是否與報道時間不同或者與地區(qū)差異有關(guān)，需進(jìn)一步調(diào)查研究分析。不同地域HPV感染陽性率和型別存在差異[10]。安徽蚌埠地HPV陽性率為22.40%[11]。遼寧省HPV感染率為35.66%，最主要感染型別為HPV16、HPV58、HPV52、HPV33、HPV53、HPV31[12]；湖南省HPV感染率為22.60%，最常見型別為HPV16、HPV52、HPV58、HPV18、HPVCP8304[13]；深圳市HPV感染率為16.60%，最常見型別為HPV16、HPV52、HPV58、HPV31、HPV39[14]；廣州地區(qū)常見的HPV亞型依次為HPV52、HPV58、HPV16[15]。本文研究結(jié)果顯示，湛江地區(qū)最常見的亞型是HPV52、HPV16、HPV8304、HPV58、HPV53，感染率分別為4.9%、3.1%、2.2%、2.1%、1.6%。西方國家HPV16和HPV18是兩個主要的基因型，與70%的宮頸癌發(fā)生相關(guān)[16]。據(jù)報道，近幾年國內(nèi)HPV總體感染率為21.69%[17]。本文實驗結(jié)果還顯示2017-2020年間的感染率明顯低于2012-2016年間的感染率，是否是隨著社會的進(jìn)步，大家防治意識的加強(qiáng)，或者HPV疫苗使用人數(shù)的增多，感染率下降的原因，有待進(jìn)一步研究。

據(jù)文獻(xiàn)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[18]，女性中約50%知道應(yīng)進(jìn)行宮頸癌篩查，約1/3的女性知道宮頸癌篩查的方法，并且在門診就診女性中，約1/10女性主動要求宮頸癌篩查，近一半女性做過宮頸癌篩查，但僅20.72%的女性知道應(yīng)定期行宮頸癌篩查，大多女性并沒有定期宮頸癌篩查。由此可見，大多女性對定期接受官頸癌篩查缺乏主動性和積極性，由于人們對宮頸癌篩查知識認(rèn)知的局限，我國宮頸癌篩查的宣教還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

目前HPV檢測已作為宮頸癌篩查的常規(guī)檢測項目，目前許多國家已將HPV檢測納入女性宮頸病變篩查計劃中[19]，HPV感染在不同地區(qū)存在地域性差異，通過對本地區(qū)宮頸病變患者進(jìn)行HPV分型檢測及流行病學(xué)調(diào)查，了解本地區(qū)HPV基因亞型分布特點對宮頸癌的早期防治和疫苗研發(fā)有重要意義。目前，HPV感染無特效藥，也缺乏療效顯著的療法。盡管HPV疫苗已研制成功并在國內(nèi)上市，但是價格貴，且不能預(yù)防所有的HPV亞型感染。因此，HPV感染的預(yù)防工作至關(guān)重要。流行病學(xué)研究[20]證實高危型HPV感染的檢測是宮頸癌預(yù)防的關(guān)鍵。HPV疫苗是公認(rèn)的預(yù)防宮頸癌的有效措施，我國先后于2016年7月、2017年5月和2018年4月批準(zhǔn)二價疫苗、四價疫苗和九價疫苗在大陸上市，并于2019年12月批準(zhǔn)首個國產(chǎn)二價HPV疫苗上市。