張條條，許志華，徐昌隆

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

0 引言

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是世界上最常見的癌癥之一[1]。在中國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中排名第四[2]。目前，根治性手術(shù)仍是結(jié)直腸癌唯一有效的治療方法，早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌對(duì)患者的預(yù)后至關(guān)重要。約35%-55%的晚期結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)肺、肝臟轉(zhuǎn)移[3,4]?？偟膩碚f，傳統(tǒng)治療方法(手術(shù)、放療、化療、中藥治療)療效不顯著。因此，臨床迫切需要新的治療靶點(diǎn)來治療結(jié)直腸癌。

GNL3L是一種含582個(gè)氨基酸的GTP結(jié)合核仁蛋白，在核仁前rRNA加工和細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用[5-6]。在乳腺癌細(xì)胞MCF-7[7]中，GNL3L作為一種核細(xì)胞質(zhì)穿梭蛋白，通過其C端的核輸出信號(hào)區(qū)能夠與出核因子1(Chromosome region maintenance1，CRM1)相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。Thoompumkal等人報(bào)道GNL3L能與癌癥亮氨酸拉鏈下調(diào)因子1(Leucine zipper down-regulated in cancer-1，LDOC1)相互作用，并在腫瘤發(fā)生過程中通過NF-κB通路調(diào)控HEK293T細(xì)胞的增殖和凋亡[5]。

然而，關(guān)于針對(duì)GNL3L在結(jié)腸癌進(jìn)展中作用的研究相對(duì)較少，其潛在機(jī)制尚不清楚。因此，本研究的目的是利用公共數(shù)據(jù)庫研究GNL3L在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能和機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明，GNL3L在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)并對(duì)預(yù)后有影響，并可能對(duì)MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生影響。

1 材料和方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫檢測結(jié)直腸癌中GNL3L的表達(dá)水平

首先我們?cè)贕EPIA中檢索癌組織中GNL3L的表達(dá)情況，并比較結(jié)直腸癌與對(duì)照組的表達(dá)差異。然后，在CCLE中下載57個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的GNL3L表達(dá)數(shù)據(jù)。接著，在GEO數(shù)據(jù)庫篩選12個(gè)微陣列的數(shù)據(jù)，樣本信息見表1。數(shù)據(jù)均來自2019年11月之前上傳的微陣列和RNA測序?qū)嶒?yàn)。之后我們?cè)赗環(huán)境下應(yīng)用RMA算法對(duì)原始GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化并轉(zhuǎn)換為表達(dá)值(v3.5.3)[8]。使用R的“sva”包來移除跨平臺(tái)的批處理效果。比較腫瘤組織和癌旁組織中GNL3L在單系列數(shù)據(jù)集和單平臺(tái)數(shù)據(jù)集的表達(dá)情況。最后采用標(biāo)準(zhǔn)化均值差法評(píng)估連續(xù)變量GNL3L的表達(dá)。當(dāng)異質(zhì)性(I2)＞50%時(shí)，將數(shù)據(jù)與隨機(jī)效應(yīng)模型相結(jié)合。結(jié)果以森林圖的形式呈現(xiàn)。

表1 從GEO中選擇的數(shù)據(jù)集

1.2 GNL3L的臨床特征分析

我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取GNL3L的表達(dá)數(shù)據(jù)及其對(duì)應(yīng)的臨床信息。使用Perl軟件對(duì)每個(gè)表達(dá)式的重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，并進(jìn)行均一化處理。結(jié)合TCGA提供的年齡、性別、腫瘤分期、組織學(xué)分級(jí)等數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素和多因素Cox分析。

1.3 生物學(xué)功能分析

通過GEPIA和Coexpedia在線工具篩選可能參與結(jié)直腸癌發(fā)展的GNL3L相關(guān)基因[9]。然后，利用DAVID 6.8進(jìn)行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GNL3L在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中過表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)庫中，GNL3L在結(jié)腸癌組織中過表達(dá)(見圖1A和B)?；贑CLE數(shù)據(jù)，GNL3L在不同類型結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌組織趨勢一致(見圖1C)。在12個(gè)GEO基因芯片中，結(jié)直腸癌組織中GNL3L的表達(dá)水平較對(duì)照組織明顯升高(見圖1D)。在同一平臺(tái)中去除批次無效應(yīng)后也觀察到這一趨勢。綜合meta分析顯示，GNL3L在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織(SMD=2.20，95%置信區(qū)間(CI)：1.42-2.98；P＜0.001)(見圖2A)。此外，森林圖去除批次效應(yīng)在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)一致的表達(dá)趨勢(SMD=2.10，95% CI：1.29-2.92，P＜0.001)(見圖2B)。

圖1 GNL3L在數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)情況

圖2 GNL3L表達(dá)的森林圖

2.2 GNL3L在結(jié)直腸癌中的臨床價(jià)值評(píng)價(jià)

我們?cè)赥CGA中提取結(jié)直腸癌患者GNL3L的表達(dá)值及其臨床特征信息，發(fā)現(xiàn)GNL3L的表達(dá)和性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織密切相關(guān)(見表2)。然而，GNL3L與其他臨床參數(shù)沒有顯著關(guān)聯(lián)。這可能是由于樣本量不足。隨后，我們通過單因素Cox分析發(fā)現(xiàn)，GNL3L表達(dá)水平、年齡、TNM、腫瘤分期與預(yù)后顯著相關(guān)。同時(shí)，多因素分析顯示GNL3L表達(dá)水平、年齡、N分級(jí)、M分級(jí)可能是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(見表3)。

表2 GNL3L的表達(dá)及與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌患者總生存期的Cox回歸模型分析

2.3 利用公共數(shù)據(jù)庫分析GNL3L的生物學(xué)功能

為了明確GNL3L潛在的生物學(xué)功能，我們分析了與GNL3L表達(dá)相關(guān)的基因表達(dá)變化。利用GEO和TCGA數(shù)據(jù)分別通過Coexpedia和GEPIA構(gòu)建GNL3L共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。接著，利用DAVID工具對(duì)鑒定的共表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析(見圖3A和B)。KEGG通路分析顯示，富集最顯著的通路與“核糖體”“泛素介導(dǎo)的蛋白水解”“甲狀腺激素信號(hào)通路”“細(xì)胞周期”和“MAPK信號(hào)通路”相關(guān)。

圖3 GNL3L在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能分析

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，可能受癌基因和抗癌基因之間的不平衡以及相關(guān)信號(hào)通路的改變所影響。然而，我們對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)展和發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然不完整。因此，明確結(jié)直腸癌的分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌靶向治療確定新的生物標(biāo)志物是當(dāng)務(wù)之急。GTP結(jié)合蛋白可水解三磷酸核苷酸，作為信號(hào)轉(zhuǎn)化器或分子開關(guān)，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、增殖、分化和凋亡等關(guān)鍵細(xì)胞事件[7,10,11]。在人類疾病中已經(jīng)觀察到異常的GTPase信號(hào)，包括許多不同類型的癌癥。人們對(duì)確定GTP結(jié)合蛋白在癌癥發(fā)展和進(jìn)展中的潛在作用越來越感興趣。

GNL3L是GTP結(jié)合蛋白家族的成員，是脊椎動(dòng)物核干細(xì)胞因子(Nuleostemin，NS)和GNL2的同源類似物。NS在胚胎神經(jīng)干細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)[12]，與NS一樣，GNL3L也參與細(xì)胞生長和增殖[13]。最近的一項(xiàng)分析發(fā)現(xiàn)，與配對(duì)的正常組織相比，各種腫瘤中GNL3L表達(dá)水平顯著升高，尤其是結(jié)直腸癌、食管癌和胃癌[14]。我們的結(jié)果與這個(gè)分析一致。TCGA、GEO和CCLE數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌中GNL3L的表達(dá)顯著升高。

然而，目前尚不清楚GNL3L如何促進(jìn)結(jié)直腸癌，確定其潛在機(jī)制應(yīng)是未來工作的重點(diǎn)。我們鑒定了與GNL3L共同表達(dá)的基因，并進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)GNL3L的功能可能與MAPK信號(hào)通路有關(guān)(P=0.03)。MAPK通路在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，引起炎癥反應(yīng)和凋亡等生理反應(yīng)[15,16]。Ras/Raf/MEK/ERK途徑是經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有MAPKs的三級(jí)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。ERK/MAPK通路的異常激活或失調(diào)容易導(dǎo)致細(xì)胞增殖和生長失控，導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化和癌癥發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，Ras/Raf/MEK/ERK通路的激活有助于誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，參與結(jié)直腸癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。考慮到這些特性，我們認(rèn)為GNL3L過表達(dá)可能影響MAPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和生長。

綜上所述，我們的研究結(jié)果揭示了GNL3L在結(jié)直腸癌中過表達(dá)，并可能通過影響MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。這是GNL3L在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的致癌信號(hào)傳導(dǎo)的新機(jī)制，提示GNL3L是一種有前景的治療靶點(diǎn)。