鈕怡清

(上海市食品研究所，上海，200235)

香辛料主要是指一類具有芳香、辛辣等典型風(fēng)味的天然植物制品。在古時(shí)，人們就開(kāi)始在飲食中使用一些具有刺激性的芳香植物，其精油含量較高，有強(qiáng)烈的呈味、呈香作用，不僅能促進(jìn)食欲，改善食品風(fēng)味，還具有抗氧化的作用。香辛味香料種類繁多，其中，有熱感和辛辣感的香料主要包含辣椒、胡椒、花椒等。食用色素又稱食品著色劑，消費(fèi)者可適量食用，其在一定程度上能改變食品原有顏色的食品添加劑，分為天然著色劑和合成著色劑兩大類[1]。合成著色劑由苯、甲苯和萘等化工產(chǎn)品經(jīng)化學(xué)合成而制成[2]，因其具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、顏色多樣、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛。然而，合成色素中含砷、鉛、銅、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸鹽，大量食用會(huì)對(duì)人體造成不同程度的危害，可能導(dǎo)致生育力下降，增加人體的致癌率，加重或惡化多動(dòng)癥癥狀。近年來(lái)，因非法添加合成色素而引發(fā)的食品安全事件屢見(jiàn)不鮮，如辣椒制品中的蘇丹紅、香辛料中的羅丹明B[3]、香腸中的胭脂紅等。

目前，食品中非法使用合成色素的現(xiàn)象主要包括3種情況，即超標(biāo)、超范圍和非法使用添加物，為此，各國(guó)都建立了嚴(yán)格的法律法規(guī)加以規(guī)范。我國(guó)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)食品中允許使用的合成色素種類、使用范圍和限量進(jìn)行了詳細(xì)的規(guī)定。食品中合成色素的檢測(cè)技術(shù)多種多樣，包括分光光度法[4]、酶聯(lián)免疫法[5-6]、薄層色譜法[7]、拉曼光譜法[8-9]、毛細(xì)管電泳法[10-11]、示波極譜法[12]、以及HPLC[13-14]。相較于其他方法，HPLC分離效果好、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣[15]、檢測(cè)低限低。國(guó)內(nèi)對(duì)檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃及誘惑紅這5種色素主要依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.35—2016、SN/T 1743—2016，采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)。香辛料產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，油脂含量高，粉末細(xì)膩，常用的前處理方法為溶劑提取法[16-17]、聚酰胺吸附法[18-20]和固相萃取法[21-24]。溶劑提取法操作簡(jiǎn)單，但提取率低，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的樣品提取不完全；聚酰胺吸附法操作繁瑣，含大量脂肪和大分子的物質(zhì)還需要經(jīng)葡聚糖凝膠色譜進(jìn)一步凈化。更為重要的是，這2種方法均不適用于香辛料類產(chǎn)品，因此，有必要建立一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、有效的樣品前處理方法對(duì)香辛料中合成色素進(jìn)行檢測(cè)。

本文結(jié)合樣品基質(zhì)特點(diǎn)，通過(guò)研究香辛料中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅5種合成著色劑的前處理方法，建立了由正己烷脫脂，乙腈-水除雜，聚酰胺固相萃取柱凈化富集，乙醇-氨水-水提取色素的前處理方法。本檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)，為今后復(fù)雜基質(zhì)中多種合成著色劑的提取檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)制定提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品

檸檬黃、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL。

1.2 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：香辛料來(lái)源于市售，均質(zhì)后室溫貯藏；甲醇、乙腈(色譜純)，德國(guó)默克公司；乙酸銨(色譜純)、聚酰胺粉小柱，美國(guó)Cleanert；所有實(shí)驗(yàn)室用水為一級(jí)水。

實(shí)驗(yàn)儀器：U3000高效液相色譜儀，Thermo Fisher公司；CT14RD高速冷凍離心機(jī)，TECHCOMP公司；氮吹儀，ANPEL公司。

1.3 儀器條件

高效液相色譜條件：色譜柱：Waters Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器，掃描范圍：400～800 nm；流動(dòng)相A為乙酸銨溶液(0.2 mol/L)，流動(dòng)相B為甲醇；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL；采用的梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program of LC

1.4 樣品提取

稱取2.000 g樣品置于50 mL刻度離心管中，加入20 mL正己烷，渦旋振蕩5 min，4 000 r/min離心 5 min，棄去正己烷層，再用正己烷重復(fù)脫脂3次。脫脂后的樣品置于70 ℃水浴揮干殘留的正己烷。向樣品中加入10 mL乙腈-水(體積比,9∶1)溶液，超聲30 min，離心取上清液，用乙腈-水溶液重復(fù)提取2次，合并提取液，70 ℃水浴氮吹干；向上述樣品中再加入10 mL水提取，重復(fù)提取直至提取液無(wú)色或近無(wú)色，將水層合并至氮吹干的乙腈提取液離心管中，渦旋混勻。將上述溶液全部置于聚酰胺固相萃取小柱凈化，待試樣全部流出后，依次用 6 mL 0.5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-甲醇溶液，6 mL水清洗，棄去全部流出液，抽干。用6 mL乙醇-氨水-水(體積比，7∶2∶1)洗脫，收集洗脫液，置80 ℃水浴氮吹至干，用1 mL水渦旋定容，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過(guò)濾后供液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

由于香辛料基質(zhì)復(fù)雜，油脂含量大，粉末細(xì)膩，對(duì)后期聚酰胺小柱過(guò)柱效率影響極大，提取液的選擇對(duì)5種色素的提取效率影響顯著。本實(shí)驗(yàn)以花椒粉(n=30)為預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象，考察了：(1)丙酮-水(體積比，8∶2)；(2)乙腈-水(體積比，9∶1)；(3)純水；(4)丙酮-水和水2次提取；(5)乙腈-水和水2次提取對(duì)加標(biāo)回收樣品的提取效果。5種提取方法對(duì)檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅的加標(biāo)回收見(jiàn)表2。

表2 不同提取方法對(duì)5種合成色素的加標(biāo)回收率 單位：%Table 2 Recoveries of five synthetic pigments by different extraction methods

由表2可見(jiàn)，水對(duì)檸檬黃、日落黃的提取效果較好，乙腈水對(duì)莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅的提取效果最優(yōu)，因此，選取乙腈水+水2次提取的方式進(jìn)行優(yōu)化研究。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

使用二極管陣列檢測(cè)器，被測(cè)物質(zhì)的定性分析不僅可以通過(guò)保留時(shí)間進(jìn)行確定，還可通過(guò)光譜吸收曲線的模式圖形狀、最大吸收波長(zhǎng)、峰純度分析等參數(shù)進(jìn)行輔助定性分析，以提高高效液相色譜的定性分析能力，采用分段掃描的方式，使每一種合成色素出峰處都處于其最大吸收波長(zhǎng)處。各組分的最大吸收波長(zhǎng)如表3所示，液相色譜圖如圖1所示。

表3 五種合成色素的最大吸收波長(zhǎng)Table 3 The maximum absorbance wavelength of five synthetic pigments

圖1 五種合成色素的混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(質(zhì)量濃度為10 μg/mL)Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard (10 μg/mL)

2.3 方法驗(yàn)證

采用空白基質(zhì)(辣椒、花椒粉)加標(biāo)回收的方式對(duì)上述樣品前處理過(guò)程及液相條件進(jìn)行方法驗(yàn)證。依照GB/T 27417—2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[25]從檢出限(limits of detection，LOD)、定量限(limit of quantitation，LOQ)、線性(r)、準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率)、精密度(重現(xiàn)性，RSD)對(duì)方法進(jìn)行評(píng)估。其中，以定性離子通道信噪比(S/N)為3時(shí)樣品溶液種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為L(zhǎng)OD。

2.3.1 線性關(guān)系與檢測(cè)低限

由于本研究方法為外標(biāo)定量法，以峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如表4所示，5種合成色素的相關(guān)性系數(shù)(r)均大于0.999，濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。表4中同樣列出了方法的LOD。

表4 五種合成色素線性相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 4 r values of the matrix-matched calibration curves, supplemented with limits of detection (LOD) for all analytes

2.3.2 回收率與精密度

在空白辣椒、花椒粉樣品中添加3個(gè)濃度水平的合成色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平6個(gè)平行樣品，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表5。辣椒樣品中色素添加量為0.5～5 mg/kg時(shí)，回收率為66%～92%、相對(duì)偏差(RSD)為1.5%～7.7%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確性、精密度良好。

表5 方法、回收率及精密度(n=6)Table 5 Relative abundance ratio deviatio, recovery and precision of the method (n=6)

2.4 市售香辛料中5種合成色素含量分析

在優(yōu)化、驗(yàn)證了前處理方法和儀器條件后，對(duì)市售辣椒、花椒粉(n=70+35)進(jìn)行了采樣并處理分析。結(jié)果表明，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅在105個(gè)樣本中均未檢出，暴露水平低。通過(guò)平行樣品的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，此方法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、靈敏度強(qiáng)，能滿足日常對(duì)于香辛料中合成色素檢測(cè)的需求。

2.5 本文方法與國(guó)標(biāo)方法的差異性討論

目前，對(duì)食品中合成色素的檢測(cè)主要依據(jù)GB 5009.35—2016[26]，但該法適用的食品種類不包含辣椒、花椒粉，故前處理過(guò)程無(wú)脫脂、去油的過(guò)程，僅使用溫水溶解，采用聚酰胺粉吸附色素，最后用水定容。圖2為空白辣椒樣品(圖2-a)、加標(biāo)樣品按國(guó)標(biāo)法提取(圖2-b)、相同加標(biāo)量加標(biāo)樣品按本文前處理方法提取(圖2-c)的液相色譜圖。由圖2可知，按照國(guó)標(biāo)法處理辣椒樣品，回收率僅有20%，對(duì)5種合成色素的提取率極低，同時(shí)雜質(zhì)提取不完全也會(huì)對(duì)檢測(cè)器和色譜柱產(chǎn)生較大的損傷；而使用本文的前處理方法則能很好地去除樣品中的雜質(zhì)，采用聚酰胺小柱替代聚酰胺粉，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程更簡(jiǎn)單，避免了重復(fù)洗脫的過(guò)程，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)大大提高了5種合成色素的回收率(70%～80%)。

a-樣品；b-國(guó)標(biāo)法加標(biāo)回收；c-本方法加標(biāo)回收?qǐng)D2 樣品、國(guó)標(biāo)法加標(biāo)回收、本方法加標(biāo)回收的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample, extracted by GB 5009.35—2016, extracted by n-hexane, CN and water

3 結(jié)論

本研究采用HPLC法對(duì)國(guó)產(chǎn)市售辣椒、花椒粉中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅5種合成色素進(jìn)行了檢測(cè)，使用正己烷脫脂的方法，降低油脂對(duì)小柱凈化的影響，以乙腈-水和水2次提取合并提取液的方法，提高了提取效率，采用外標(biāo)法定量，效果良好。本方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)香辛料中合成色素的含量水平，方法檢出限為0.5 mg/kg，滿足國(guó)內(nèi)外的檢測(cè)要求，并可適用于其他復(fù)雜基質(zhì)的多種合成色素的檢測(cè)，為食品安全檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作提供技術(shù)支持。