胡旺，陳夢(mèng)娟，尹含靚，李孝仁，蔣立文*

1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410125)2(湖南至善食品有限公司，湖南 長(zhǎng)沙，410016)

霉豆腐又稱鹵腐、腐乳或醬豆腐等，是將大豆按照常規(guī)工序制成白豆腐坯后，經(jīng)過接種或自然發(fā)酵、腌制、加配料后發(fā)酵等工藝制作而成的一種傳統(tǒng)風(fēng)味發(fā)酵食品[1-2]，富含氨基酸、蛋白質(zhì)、大豆異黃酮等成分，且膽固醇和脂肪的含量較低，憑借其細(xì)膩的口感和特殊的風(fēng)味深受消費(fèi)者的喜愛[3]。霉豆腐在生產(chǎn)過程中由于微生物分泌的酶系的作用，蛋白質(zhì)被分解成多肽和氨基酸，淀粉轉(zhuǎn)化為糖類，并在多種微生物的共同作用下繼續(xù)形成有機(jī)酸、醛、醇、酮等成分[4]。有研究者利用電子舌技術(shù)發(fā)現(xiàn)鮮味、咸味、苦味、豐富度是腐乳的主要滋味屬性[5]。我國(guó)幅員遼闊，不同地區(qū)氣候差異顯著，因而產(chǎn)生了許多具有鮮明地方特色風(fēng)味的霉豆腐產(chǎn)品，例如紹興腐乳、桂林腐乳、北京王致和腐乳、克東腐乳等[6]。這些腐乳除克東腐乳以細(xì)菌發(fā)酵為主形成品質(zhì)特色外其余產(chǎn)品均以霉菌發(fā)酵為主，所以產(chǎn)品特色差異明顯。瀏陽(yáng)“霉豆腐”實(shí)際上也是一種細(xì)菌型發(fā)酵的豆腐制品，因?yàn)樽匀话l(fā)酵過程中并不“長(zhǎng)霉”，而是依賴在25～32 ℃將白豆腐置于發(fā)酵室中自然發(fā)酵48 h，待表面開始出現(xiàn)黏狀物后，經(jīng)過一定時(shí)間白酒浸泡濾干，拌入食鹽、辣椒粉、香辛料等直接裝入玻璃瓶、用植物油覆蓋進(jìn)行發(fā)酵1個(gè)月左右制成，產(chǎn)品品質(zhì)風(fēng)味與其他霉豆腐有較大的差別，但這種差別與形成品質(zhì)機(jī)理存在多少相關(guān)性仍缺乏基礎(chǔ)研究。

關(guān)于霉豆腐及克東腐乳發(fā)酵過程中細(xì)菌群落及與品質(zhì)風(fēng)味之間的關(guān)聯(lián)性已經(jīng)有很多學(xué)者進(jìn)行了研究，如張雅婷等[7]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和霉菌以及腐乳菌群結(jié)構(gòu)是影響腐乳發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)變化的主要原因。萬(wàn)紅芳等[8]研究認(rèn)為，來(lái)自環(huán)境及原材料中其他微生物的侵入與人工接種的發(fā)酵菌種混合形成了復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，對(duì)腐乳品質(zhì)風(fēng)味的形成產(chǎn)生重要影響。劉井權(quán)等[9]、陳曦等[10]研究發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌(Micrococcus)在腐乳發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶，可以增加腐乳中游離氨基酸的含量，有益于提高腐乳的風(fēng)味和品質(zhì)。曲霉屬(Aspergillus)和放線菌屬(Actinomucor)是水解酶產(chǎn)生菌，在腐乳中含量豐富[11]。

本文對(duì)采取常規(guī)方法結(jié)合Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)瀏陽(yáng)霉豆腐生產(chǎn)中關(guān)鍵步驟豆腐制備、發(fā)酵24 h、發(fā)酵48 h、酒水浸泡、豆腐半成品5個(gè)階段進(jìn)行細(xì)菌群落變化分析，期待為這一傳統(tǒng)特色產(chǎn)品創(chuàng)新升級(jí)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 豆腐樣品的采集

供試驗(yàn)材料為5組，包括白豆腐坯、自然發(fā)酵24 h、自然發(fā)酵48 h、酒水浸泡、豆腐半成品樣品，對(duì)應(yīng)編號(hào)分別為：DBDF、DF24、DF48、DJS、DBC，樣品采集于瀏陽(yáng)某品牌企業(yè)。所有試驗(yàn)樣品源在4 ℃低溫條件下運(yùn)輸至試驗(yàn)室。部分樣品直接用于菌落總數(shù)測(cè)定，部分樣品按照每組樣品原料搗碎加入適量無(wú)菌水混合并使用孔徑為0.45 μm的水系濾膜進(jìn)行過濾，將濾膜及沉淀裝入已滅菌的10 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱保藏。

1.1.2 材料與試劑

PCA培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5.0、酵母浸粉 2.5、葡萄糖1.0、瓊脂15.0,pH(7.0±0.2),用于菌落總數(shù)的測(cè)定。

Pusion Hot start flex 2X Master Mix，用于PCR的擴(kuò)增，上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Maker，用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Gene colour，用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳的染色，北京金博益生物技術(shù)有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit，用于DNA的定量檢測(cè)，美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司；Biowest Agarose G-10，用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳，西班牙Biowest公司；50×TAE Buffer，用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳，上海生工生物工程股份有限公司；AxyPrep PCR Cleanup Kit，用于PCR Cleanup，美國(guó)Axygen公司；Stool DNA Kit，用于DNA的提取，美國(guó)Omega Bio-Tek公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

5424型常溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf Centrifuge公司；Microfuge 22R型冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；WH-861型旋渦振蕩儀，太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DK-8D型三溫三控恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；A200型PCR儀，用于PCR擴(kuò)增，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；MiSeq pe300測(cè)序儀，用于DNA測(cè)序，美國(guó)Illumina 公司 ；Tanon-2500型電泳儀、凝膠成像儀，用于PCR產(chǎn)物檢測(cè)，上海天能公司；DW-HL388型超低溫冷凍貯存箱，中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品中菌落總數(shù)的測(cè)定

采用GB 4789.2—2016[12]進(jìn)行不同階段樣品菌落總數(shù)的檢測(cè)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和16S rDNA測(cè)序方法

按照Stool DNA Kit(OMEGA bio-tek)說(shuō)明書提取DNA后，對(duì)微生物總DNA進(jìn)行16S rDNA V3～V4區(qū)域擴(kuò)增。擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA中V3～V4區(qū)所選用的引物為：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR體系為25 μL包含DNA模板25 ng、上下游引物各為2.5 μL、12.5 μL PCR預(yù)混合物。

PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃循環(huán)35次，變性10 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格樣品送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序[13-14]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)首先根據(jù)樣品的條形碼(barcode)信息對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，再根據(jù)雙端序列的重疊(overlap)關(guān)系，將序列拼接(merge)成長(zhǎng)的tags，并將序列上建庫(kù)引入的barcode和引物序列去除。使用Vsearch(V2.3.4)軟件過濾掉質(zhì)量值低的序列以及嵌合體序列[15]。再將具有97%以上相似性的序列分配給相同的可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)。每個(gè)OTU選擇代表性序列，然后使用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目(ribosomal database project，RDP)分類器將數(shù)據(jù)歸類到每個(gè)代表性序列。利用MAFFT(V7.310)軟件對(duì)不同類群優(yōu)勢(shì)種群的差異進(jìn)行多序列比對(duì)，研究不同OTU間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。以Chao 1、Shannon、Simpson和Observed species為指標(biāo)，用QIIME(1.8.0版)計(jì)算了所有樣品的各項(xiàng)指標(biāo)并進(jìn)行聚類，再通過Alpha及Beta多樣性分析單個(gè)樣本中物種的多樣性以及樣本間菌群結(jié)構(gòu)之間的差異[16-17]。根據(jù)每個(gè)OTU代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)和Unite數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，得到各個(gè)樣本所有OTU的物種注釋，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類統(tǒng)計(jì)后獲得門水平和屬水平上的物種豐度表。

1.3 樣品數(shù)量及數(shù)據(jù)處理

按照生物學(xué)樣品處理基本要求，菌落總數(shù)測(cè)定為3個(gè)重復(fù)，所有生物學(xué)重復(fù)樣品均為4個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段菌落總數(shù)變化

如表1不同階段菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果所示，不同階段樣品中的細(xì)菌數(shù)量均較高，均達(dá)到106CFU/g以上，且在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到計(jì)數(shù)最大值。發(fā)酵48 h時(shí)，菌落總數(shù)達(dá)到了2.2×109CFU/g，而隨后到酒水浸泡30 s時(shí)，菌落總數(shù)明顯降低，可能是因?yàn)橐掖嫉淖饔?，不僅殺死了樣品中部分細(xì)菌，也有部分轉(zhuǎn)移到酒水中，導(dǎo)致菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯著降低。而半成品階段菌落總數(shù)仍然降低的可能原因是香辛料中加入了大量食鹽和植物油。

表1 不同階段菌落總數(shù)變化Table 1 Changes in the total number of colonies at different stages

2.2 不同發(fā)酵階段的clean data

為提高后續(xù)分析質(zhì)量和可信度，對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙端拼接、質(zhì)量控制、嵌合體過濾后，對(duì)本次測(cè)序中的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，結(jié)果如表2所示。

表2 不同發(fā)酵階段樣品16S rDNA測(cè)序獲得的有效數(shù)據(jù)Table 2 Valid data obtained by 16S rDNA sequencing of samples at different fermentation stages

其中有效序列數(shù)均在74 000條以上，Q20值均超過97%，并且Q30值均超過了97%，這些數(shù)據(jù)結(jié)果表明本次測(cè)序結(jié)果較好，測(cè)序質(zhì)量值較高，所有數(shù)據(jù)都已達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)分析的要求。

2.3 OTU聚類分析

由圖1可知，DBDF中僅有367個(gè)OTU，而后進(jìn)入控溫發(fā)酵階段，環(huán)境中微生物及豆腐自身帶入微生物生長(zhǎng)增殖，樣品中微生物總數(shù)在增加，發(fā)酵24 h有485個(gè)OTU，而DF48樣品中則有541個(gè)OTU。但在DJS樣品中僅測(cè)得475個(gè)OTU，與酒水浸泡后部分微生物進(jìn)入酒水中有關(guān)，而從DJS樣品過渡到DBC樣品階段，樣品中的OTU未發(fā)生明顯變化。DBDF、DF24、DF48、DJS、DBC 5個(gè)樣品中，獨(dú)有的OTU數(shù)分別為92、122、263、129、115，其變化趨勢(shì)與不同階段樣品中的總OTU數(shù)變化趨勢(shì)基本吻合，說(shuō)明在不同的階段微生物種類和微生物群落結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生演變。5個(gè)樣品中共有的OTU數(shù)為113，說(shuō)明這些微生物在霉豆腐形成的各個(gè)階段比較穩(wěn)定但其他種類的微生物出現(xiàn)交替變化，這種變化應(yīng)該與不同階段環(huán)境變化有關(guān)。

圖1 不同發(fā)酵階段中細(xì)菌OTU的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of bacterial OTU in different fermentation stages

2.4 不同發(fā)酵階段樣品的細(xì)菌α-多樣性分析

α-多樣性是指一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)或者特定區(qū)域內(nèi)微生物的多樣性，一般使用包括反應(yīng)群落豐度的Chao 1、Ace等指數(shù)和用來(lái)反應(yīng)群落多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等進(jìn)行度量分析[18]。由表3可知，白豆腐中微生物的種類是最少的，這是白豆腐本身經(jīng)過高溫?zé)崽幚砗蟮玫降?，但進(jìn)入發(fā)酵階段后，微生物的種類(Chao1指數(shù))呈現(xiàn)先增加后降低再上升的趨勢(shì)，但微生物的多樣性和均勻度(Shannon指數(shù))為先升高再降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)闃悠吩诮?jīng)過酒水浸泡后拌入了辣椒、香辛料等帶入新的微生物，導(dǎo)致Chao 1指數(shù)有小幅度的上升。在發(fā)酵48 h時(shí)，樣品中的微生物種類、微生物的多樣性、均勻度都達(dá)到了最高值，此結(jié)果與OTU聚類分析結(jié)果相似。

表3 不同階段細(xì)菌的α-多樣性分析Table 3 Analysis of α-diversity of bacteria in different stages

2.5 不同發(fā)酵階段細(xì)菌β-多樣性分析

由圖2可知，在主成分分析(principal component analysis，PCA)中，兩坐標(biāo)軸的貢獻(xiàn)率之和為81.06%，說(shuō)明已經(jīng)能夠反映樣品中的大部分信息。發(fā)酵48 h的樣品(DF48)的微生物菌群與其他樣品中的微生物菌群結(jié)構(gòu)差異很大，可能是發(fā)酵基本成熟，發(fā)酵微生物無(wú)論數(shù)量種類都是最多的。而DBDF、DF24、DJS 3個(gè)樣品相距較近，說(shuō)明三者菌群結(jié)構(gòu)相似度較高，DBC樣品與其他樣品相距較遠(yuǎn)，分析原因可能是加入食鹽、辣椒面、香辛料、植物油后菌相有些變化開始進(jìn)入后期厭氧發(fā)酵階段，菌群結(jié)構(gòu)基本趨于穩(wěn)定。

2.6 不同發(fā)酵階段物種中門水平、屬水平差異性

由圖2可知，將全部OTU代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)和Unite數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到各個(gè)樣本所有OTU的物種注釋[19]。根據(jù)物種注釋結(jié)果，在門和屬2個(gè)水平上對(duì)物種組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并構(gòu)建對(duì)應(yīng)的豐度譜[20]，得到對(duì)應(yīng)的豐度譜如圖3、圖4所示。

圖2 不同階段PCA結(jié)果圖Fig.2 PCA results of different stages

圖3 門水平豐度譜及Bray-Curtis聚類分析Fig.3 Abundance spectrum and Bray-Curtis cluster analysis at the phylum level

由圖3可知，在門水平上，所采集的5個(gè)樣品均是以變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主，其中，在DBDF、DF24、DF48、DJS、DBC 5個(gè)樣品中，變形菌門相對(duì)豐度均超過70%，分別達(dá)到了71.25%、87.53%、80.64%、79.65%、82.79%，而厚壁菌門也達(dá)到了11.64%～28.50%。由此可見，變形菌門和厚壁菌門在樣品中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。值得注意的是，在DBDF、DF24、DF48、DJS、DBC 5個(gè)樣品中，擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度占比非常低，僅僅只有0.14%、0.50%、0.93%、0.55%、0.32%，這與石黎琳等[21]的研究存在較大差異，該研究中第2階段擬桿菌門的豐度占比達(dá)到了49%，而瀏陽(yáng)霉豆腐第2階段中僅有0.32%。這應(yīng)該是導(dǎo)致瀏陽(yáng)霉豆腐具有特殊風(fēng)味以及與其他霉豆腐品質(zhì)存在差異的主要原因，但這仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究確定。

由圖4可知，本試驗(yàn)在屬水平上一共注釋了30個(gè)屬，其中泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、假單胞菌屬(Pseudomonas)為優(yōu)勢(shì)菌屬。泛菌屬D-葡萄糖和其他糖類可產(chǎn)酸，能形成色素。陳卓等[22]發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、水棲菌(Enhydrobacter)在腐乳后發(fā)酵階段發(fā)揮十分重要的作用，多種菌協(xié)同作用使得腐乳發(fā)酵前期和中期的蛋白酶活性顯著升高。有研究表明，腸桿菌屬是腐乳中主要的組胺合成細(xì)菌[23-24]，而低劑量攝入的組胺是人體中不可或缺的生物活性物質(zhì)。明串珠菌屬在后發(fā)酵中后期均有體現(xiàn)，且在后期的比例高于中期，可能是導(dǎo)致霉豆腐后發(fā)酵期氨基酸含量不斷升高的主要原因，還有研究發(fā)現(xiàn)明串珠菌屬中的一些菌可以起到一定程度的抑菌作用，對(duì)傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌有著一定的拮抗作用。假單胞菌屬可以分解蛋白質(zhì)，在DF24、DF48階段中檢測(cè)出的含量相對(duì)較高，在發(fā)酵過程中分解大豆中的蛋白質(zhì)，并且在代謝過程中產(chǎn)丙酸、乙酸等，而這些酸是酯和長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的前體物質(zhì)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，優(yōu)勢(shì)菌屬均呈現(xiàn)出先減少后增加的變化趨勢(shì)。這與后期酒水處理和進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段有關(guān)。

圖4 屬水平豐度譜Fig.4 Abundance spectrum at the genus level

3 討論

在瀏陽(yáng)霉豆腐的形成過程中，有多種微生物參與了這一發(fā)酵的過程，隨著Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，更易于我們發(fā)現(xiàn)和掌握霉豆腐形成過程中微生物菌落的變化規(guī)律，本試驗(yàn)對(duì)采取常規(guī)方法制備的豆腐、發(fā)酵24 h、發(fā)酵48 h、酒水浸泡、豆腐半成品5個(gè)階段利用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)進(jìn)行微生物群落變化分析，從分析結(jié)果來(lái)看，霉豆腐生產(chǎn)的主要階段細(xì)菌的數(shù)量比較高，霉豆腐滋味形成與細(xì)菌代謝有著密切的聯(lián)系，但由于這類特色霉豆腐實(shí)際上并不長(zhǎng)霉，而是細(xì)菌性發(fā)酵產(chǎn)品，所以未對(duì)其他菌相進(jìn)行分析，代謝產(chǎn)物研究將在以后的研究中進(jìn)一步深入。由于瀏陽(yáng)霉豆腐為湖南地方特色發(fā)酵豆制品，下一步將進(jìn)一步研究發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)分解規(guī)律和風(fēng)味形成規(guī)律，同時(shí)結(jié)合可培養(yǎng)辦法獲得關(guān)鍵產(chǎn)蛋白酶的微生物進(jìn)行純化鑒定，同時(shí)探索發(fā)酵第2階段微生物變化與品質(zhì)風(fēng)味相關(guān)性，為這一傳統(tǒng)特色產(chǎn)品創(chuàng)新升級(jí)提供系統(tǒng)化的技術(shù)支持。