曹玉天， 盛萬(wàn)里， 齊小花， 張 偉， 謝子奇，羅云敬*， 鄒明強(qiáng)

(1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100124；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123；3.呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020)

槲皮素(Quercetin，Que)是一種廣泛存在于植物果實(shí)、茶葉、紅酒等物質(zhì)中的天然多羥基黃酮類化合物[1]，具有抗氧化[2]、抗衰老[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5,6]等藥用價(jià)值。然而，在天然產(chǎn)物中Que的含量卻很低，且結(jié)構(gòu)與其他黃酮類化合物相似，基質(zhì)復(fù)雜難于分離，因此，探究復(fù)雜基質(zhì)中Que的分離與含量測(cè)定極為重要。目前，Que常用分離方法包括溶劑萃取法、超臨界萃取法和大孔樹(shù)脂吸附法等[7]。但溶劑萃取法只適用于粗提?。怀R界萃取法成本過(guò)高；樹(shù)脂吸附法分離效果低，特異性差。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子印跡技術(shù)能夠制備出能特異識(shí)別目標(biāo)分子的分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)，有望實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中微量組分的分離。廖輝等[8]采用分子印跡技術(shù)制備Que-MIPs，該Que-MIPs對(duì)Que及結(jié)構(gòu)類似物蘆丁(Rutin,Rut)的分離因子α為1，表明MIPs對(duì)Que具有良好的特異性吸附。朱俊訪等[9]用本體聚合法制備延胡索乙素-MIPs，與延胡索乙素溶液相結(jié)合，其最大吸附容量為2.25 μmol/g，表現(xiàn)出較好的吸附效果。

磁性分子印跡技術(shù)以磁性分子印跡聚合物(Magnetic Molecularly Imprinted Polymers，MMIPs)作為固相萃取吸附劑,在外部磁場(chǎng)下直接提取復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)物，提高了吸附效率。朱安宏等[10]以Fe3O4磁性納米顆粒為載體，成功制備了Que -MMIPs，可以實(shí)現(xiàn)Que的快速分離，該聚合物最大吸附容量為0.14 mg/g。但單純磁性顆粒制備印跡材料仍存在分散性和吸附性不理想的問(wèn)題[11]。本文使用聚乙二醇(PEG)對(duì)磁芯進(jìn)行改性，增強(qiáng)了磁芯在致孔劑中的分散性，從而制備出尺寸均勻的磁性材料，提高了吸附性能。Feng等[12]采用PEG修飾的MMIPs測(cè)定醬油中的4-甲基咪唑啉，最大吸附容量達(dá)到0.8 μmol/L。PEG修飾的Que分子印跡方法尚未報(bào)道，故本研究采用PEG修飾方法制備Que -MMIPs，并對(duì)其進(jìn)行表征以及吸附性能測(cè)定，結(jié)合固相萃取技術(shù)及高效液相色譜法(HPLC)完成對(duì)實(shí)際樣品中Que含量的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(U-3010，日本日立)；高效液相色譜儀(Waters e2695 PAD-HPLC，美國(guó)沃特世)；固相萃取儀(ASPE-24，天津奧特賽思斯儀器有限公司)；紅外光譜儀(Nicolet IS10，美國(guó)尼高力)；場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(JEM2100F，日本JEOL)；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SU8020，日本日立)；振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(SQUID -VSM MPMS-3，美國(guó)Quantum Design公司)；脫色搖床(TS-A，晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)；頂置式攪拌器(TS -20，上海安譜科技股份有限公司)；雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(HJ-2B，金壇市科析儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司)。

槲皮素(Que)、丙烯酰胺(AM)、FeCl3·6H2O、蘆丁(Rut)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)，均購(gòu)于阿拉丁試劑；甲基丙烯酸(MAA)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、偶氮二異丁腈(AIBN)購(gòu)于梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；聚乙二醇(PEG)購(gòu)于羅恩試劑；FeCl2·4H2O購(gòu)于北京伊諾凱科技有限公司；NH3·H2O(25%)、冰乙酸、乙腈、甲醇、乙醇購(gòu)于福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的H3PO4水溶液；等度洗脫:比例50∶50；柱溫:30 ℃；流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng):370 nm。

1.3 Que -MMIPs的制備

1.3.1 Fe3O4磁性納米顆粒的制備參照共沉淀法[13]制備Fe3O4磁性納米顆粒。具體步驟如下:將2 mol FeCl3·6H2O和1 mol FeCl2·4H2O溶于80 mL去離子水中，于300 r/min、60 ℃條件下攪拌30 min后，滴加40 mL NH3·H2O，立即出現(xiàn)黑色沉淀。升溫至90 ℃繼續(xù)攪拌1 h，上述反應(yīng)過(guò)程均在N2氛圍下進(jìn)行。冷卻至室溫后，用外加磁場(chǎng)進(jìn)行收集分離，將產(chǎn)物先后用去離子水和無(wú)水乙醇洗滌至中性，于60 ℃干燥后，得到黑色的Fe3O4磁性納米顆粒。

1.3.2 Que -MMIPs的制備準(zhǔn)確稱取1 mmol Que和6 mmol AM溶于50 mL乙腈中，磁力攪拌12 h形成預(yù)聚合溶液。稱取一定量的Fe3O4和PEG加至30 mL的去離子水中，超聲乳化30 min。將上述溶液混勻，再加入30 mmol EGDMA和0.6 mmol的AIBN，超聲20 min后，在N2氛圍下進(jìn)行攪拌，控制溫度為60 ℃聚合24 h。反應(yīng)完成后外加磁場(chǎng)分離提取，于60 ℃烘箱干燥，然后以甲醇∶乙酸(9∶1，V/V)混合溶液為提取溶劑進(jìn)行索氏提取，直至紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)不到提取液中的Que為止，接著用甲醇索氏洗去乙酸，最后放入烘箱干燥。

磁性非分子印跡聚合物(Magnetic Non-molecularly Imprinted Polymers，MNIPs)的制備在合成步驟上與MMIPs相同，但不加模板分子。非磁性分子印跡聚合物(MIPs)和不加模板的非磁性分子印跡聚合物(Non-molecularly Imprinted Polymers，NIPs)除不加磁性乳液外，其余制備步驟均參照MMIPs和MNIPs的制備方法。

1.4 MMIPs和MNIPs的吸附性能

1.4.1 MMIPs和MNIPs的吸附容量試驗(yàn)(1)靜態(tài)吸附等溫線：在靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中，用5 mL不同濃度(10～80 μmol/L)的Que甲醇溶液，分別與20 mg的MMIPs、MNIPs、MIPs和NIPs結(jié)合。于室溫下振蕩25 min后，用外加磁場(chǎng)分離聚合物，用0.22 μm微孔膜過(guò)濾。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液中Que的含量，計(jì)算印跡聚合物對(duì)Que的吸附容量(Q)。(2)吸附動(dòng)力學(xué)曲線：在吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，分別將20 mg MMIPs和MNIPs加入到5 mL Que甲醇溶液(40 μmol/L)中。在室溫下將混合物在5～45 min的不同時(shí)間間隔中孵育。隨后用外加磁場(chǎng)將聚合物分離，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液中Que的濃度，計(jì)算Q(mg/g)。

1.4.2 MMIPs和MNIPs的吸附選擇性試驗(yàn)通過(guò)比較聚合物對(duì)Que及其結(jié)構(gòu)類似物Rut的吸附能力來(lái)評(píng)價(jià)其選擇性[14]。分別將20 mg的MMIPs和MNIPs與5 mL(40 μmol/L)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫下振搖25 min后，外加磁場(chǎng)將上清液和聚合物分離過(guò)膜。用HPLC法測(cè)定上清液中Que和Rut的含量。按照上述方法測(cè)定MMIPs、MNIPs對(duì)不同底物的結(jié)合量，分別求出靜態(tài)分配系數(shù)(Kd)及分離因子(α)，考察不同底物的吸附選擇性。

1.5 分子印跡固相萃取(MISPE)小柱的制備

在5 mL聚丙烯固相萃取空柱中均勻填入100 mg制備的MMIPs，分別在聚合物上下加蓋聚乙烯篩板，填充均勻，用玻璃棒輕輕壓實(shí)，得到柱壓適當(dāng)?shù)腗ISPE小柱。

1.6 MMIPs再生識(shí)別能力的測(cè)試

實(shí)驗(yàn)中為了測(cè)試MMIPs的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，每次將3 mL Que標(biāo)準(zhǔn)溶液(40 μmol/L)過(guò)MISPE小柱，分別經(jīng)過(guò)淋洗、洗脫直至檢測(cè)不出Que的含量，重復(fù)操作10次，測(cè)定MMIPs對(duì)Que標(biāo)準(zhǔn)溶液(40 μmol/L)的結(jié)合活性。

1.7 MMIPs對(duì)實(shí)際樣品測(cè)定

1.7.1 樣品前處理選取蘋(píng)果皮[15]、西蘭花、烏龍茶和沙棘粉作為實(shí)際樣品進(jìn)行含量測(cè)定。采用機(jī)械方法準(zhǔn)備蘋(píng)果皮、西藍(lán)花、烏龍茶和沙棘粉，將他們?cè)诤嫦涓稍锖?，分別準(zhǔn)確稱量5 g烘干后的樣品，在80 ℃條件下用無(wú)水乙醇回流冷凝提取2 h，過(guò)濾去渣，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸至近干，然后用甲醇復(fù)溶至25 mL容量瓶中作為樣品儲(chǔ)備溶液，備用。

1.7.2 樣品檢測(cè)與方法驗(yàn)證配制0、50、100、500 μmol/L不同濃度的Que標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 2 mL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液與1 mL的樣品貯備溶液混溶，過(guò)MISPE小柱，得到3 mL濾液，用3 mL甲醇淋洗MISPE小柱，最后用3 mL的甲醇∶乙酸(9∶1,V/V)作為淋洗液進(jìn)行6次洗脫，將標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品儲(chǔ)備溶液、濾液、淋洗液以及洗脫液分別用HPLC法測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)3次，計(jì)算平均檢出量、平均加標(biāo)回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 模板分子與功能單體相互作用的研究

利用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同濃度功能單體與定量的模板分子預(yù)聚物結(jié)合程度[16]。配制Que的濃度為1 mmol/L，選擇AM作為功能單體，配制不同配比的混合預(yù)組裝溶液，磁力攪拌12 h后，分別掃描300～450 nm范圍內(nèi)紫外吸收光譜，見(jiàn)圖1?？梢钥闯觯S著AM的濃度增大，預(yù)聚合后溶液的吸光度降低，并且最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，說(shuō)明AM與Que發(fā)生了作用。這是由于AM是堿性的功能單體，而Que是多酚類的酸性化合物，含有較多的羥基，它們之間具有離子間作用；另外由于它們之間形成的氫鍵也使得相互之間發(fā)生作用，形成復(fù)合物。并且由于氮原子上的多余電子對(duì)Que芳香環(huán)的供電子基效應(yīng)，使得AM最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移。因此，我們選擇結(jié)合最佳的比例1∶6來(lái)制備印跡材料。

圖1 不同比例AM預(yù)聚合的紫外吸收光譜圖

2.2 MMIPs和MNIPs的表征

2.2.1 MMIPs和MNIPs的電鏡表征圖2分別為MMIPs和MNIPs的掃描電鏡(SEM)圖。由圖A中可以看出MMIPs呈規(guī)則的團(tuán)狀聚合物，尺寸均勻，分散性好，聚合材料表面較為粗糙，說(shuō)明模板分子已洗脫，適合作為固相萃取填料；而由B圖中可以看出MNIPs呈現(xiàn)出條形狀，表面較為光滑，尺寸雜亂，不適合作為特異性吸附材料。

圖2 MMIPs(A)和MNIPs(B)的掃描電鏡(SEM)圖

圖3分別為Fe3O4和MMIPs的透射電鏡(TEM)圖。從圖3A中可以看出磁性粒子尺寸為納米級(jí)，大小較為均勻，適合作為印跡材料的磁芯；而從圖3B中可以看出深色磁芯外圍包覆著顏色較淺的分子印跡聚合物，且存在一定的空間位點(diǎn)，證明成功地制備出了磁性分子印跡材料。

圖3 Fe3O4(A)和MMIPs(B)的透射電鏡(TEM)圖

2.2.2 MMIPs和MNIPs的紅外光譜表征圖4是Fe3O4、MMIPs和MNIPs的紅外光譜圖。如圖所示，F(xiàn)e3O4在523 cm-1處的吸收帶處出現(xiàn)明顯的Fe-O鍵伸縮振動(dòng)峰，MMIPs和MNIPs譜圖中也在此位置出現(xiàn)峰形，證明Fe3O4被嵌入到聚合物中。3 500 cm-1處的峰是由AM的N-H拉伸引起的。MMIPs和MNIPs譜圖中1 671 cm-1左右的峰是AM和EGDMA中C=C的伸縮振動(dòng)峰。在MMIPs和MNIPs譜圖中，C-O-C的伸縮振動(dòng)峰為1 144 cm-1，再次表明MMIPs是由EGDMA交聯(lián)而成。以上證明磁性分子印跡聚合物制備成功。

圖4 MMIPs、MNIPs和Fe3O4的紅外光譜圖

2.2.3 MMIPs和MNIPs的磁性表征制備獲得的MMIPs必須具有超順磁特性，才能實(shí)現(xiàn)外加磁場(chǎng)的快速分離。因此，我們使用VSM來(lái)研究Fe3O4和MMIPs的磁性能。磁滯回線如圖5所示，圖上顯示沒(méi)有磁滯現(xiàn)象，結(jié)果表明Fe3O4和MMIPs具有超順磁性。Fe3O4和MMIPs的飽和磁化率分別為58.78、26.68 emu/g。由于聚合物殼層在Fe3O4表面的屏蔽作用導(dǎo)致了Fe3O4的飽和磁化強(qiáng)度降低，且MMIPs的磁性能可以滿足外加磁場(chǎng)快速分離的要求。

圖5 Fe3O4和MMIPs的磁滯回歸線

2.3 MMIPs和MNIPs的吸附性能

2.3.1 MMIPs和MNIPs的吸附容量研究了在室溫下不同濃度的Que標(biāo)準(zhǔn)溶液與MMIPs、MNIPs、MIPs和NIPs結(jié)合的吸附等溫線(圖6)。結(jié)果表明，磁性材料比非磁性材料具有更多的結(jié)合位點(diǎn)，使其具有更好的吸附性能。當(dāng)濃度小于70 μmol/L時(shí)，MMIPs的Q隨濃度的增加而快速增加。當(dāng)初始濃度超過(guò)70 μmol/L時(shí)，吸附曲線達(dá)到飽和，吸附逐漸趨于穩(wěn)定。而MNIPs在Que初始濃度大于40 μmol/L時(shí)的Q已趨于飽和，并且在相同初始濃度下MMIPs的Q遠(yuǎn)大于MNIPs的Q，證明MMIPs對(duì)Que具有很好的吸附效果。在不同濃度下，MMIPs對(duì)Que的吸附能力和識(shí)別能力均顯著高于MNIPs。這一發(fā)現(xiàn)可能與MMIPs特異印跡位點(diǎn)的存在有關(guān)。經(jīng)計(jì)算，MMIPs與Que的飽和結(jié)合能力為4.38 mg/g，約為MNIPs(1.36 mg/g)的3.2倍。

圖6 MIPs、NIPs、MMIPs和MNIPs對(duì)Que的吸附等溫線

在分析MMIPs的吸附性能時(shí)，常用Scathard模型來(lái)評(píng)價(jià)其結(jié)合特性和結(jié)合位點(diǎn)的個(gè)數(shù)。Scathard的方程式為:Q/ce=(Qmax-Q)/Kd。式中，Kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)，Qmax代表結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量，ce表示底物在上清液中的平衡濃度。以Q/ce對(duì)Q作圖，可以得到聚合物的平衡離解常數(shù)Kd及結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量Qmax。

對(duì)上述吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Scatchard分析。圖7為Scathard分析曲線。從圖可知MMIPs的Scatchard曲線呈現(xiàn)良好的線性，線性方程為：y=-2168.4x+8597.4，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.993。結(jié)合位點(diǎn)離解常數(shù)Kd=0.46 mg/L，結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量約為Qmax=3.96 mg/g。說(shuō)明在所研究的濃度范圍內(nèi)，聚合物主要形成一種結(jié)合位點(diǎn)。原因可能是在聚合過(guò)程中Que的酚羥基與AM上的氮原子通過(guò)較強(qiáng)的氫鍵和離子鍵作用形成了組成相同的復(fù)合物，且具有等價(jià)的結(jié)合位點(diǎn)。

圖7 Scathard分析曲線

由圖8可知，MMIPs的Q要高于MNIPs的Q，并且隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附量逐漸增大，吸附速率逐漸減小，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，吸附量基本保持恒定不變，最終吸附趨于平衡。因此25 min為最佳飽和吸附時(shí)間，并以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)吸附時(shí)間。

圖8 MMIPs和MNIPs對(duì)槲皮素的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

2.3.2 MMIPs和MNIPs的吸附選擇性由表1可知，MMIPs對(duì)Que和Rut的Kd分別為4.80和1.18，分離因子α=4.05；而MNIPs對(duì)Que和Rut的Kd分別為2.41和1.62，分離因子α=1.49。說(shuō)明MMIPs對(duì)Que具有較好的選擇性，其原因是MMIPs的模板分子為Que，能夠特異性識(shí)別Que并對(duì)其有選擇性地保留，而印跡材料對(duì)Rut沒(méi)有明顯的特異性吸附。

2.4 MMIPs的再生識(shí)別能力測(cè)試

從圖9中可以看出，MMIPs可以重復(fù)使用至少10次，且對(duì)Que的吸附能力沒(méi)有明顯下降，從第5次開(kāi)始吸附容量出現(xiàn)輕微的下降。結(jié)果表明MMIPs在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。

圖9 MMIPs的重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 MMIPs對(duì)實(shí)際樣品的吸附測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限配制1 mmol/L Que甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別稀釋為0、50、100、200、400、600、800 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)合HPLC法測(cè)得Que在3～800 μmol/L范圍內(nèi)，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9990。檢出限(S/N=3)為0.9 μmol/L。

2.5.2 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中對(duì)“1.7”中的4種樣品儲(chǔ)備溶液過(guò)膜進(jìn)行檢測(cè)，其中在沙棘粉中測(cè)得Que的平均檢出量為57 μmol/L，而蘋(píng)果皮、西蘭花以及烏龍茶3種樣品與Que標(biāo)準(zhǔn)溶液峰形進(jìn)行比較未發(fā)現(xiàn)Que的特征峰，3種樣品中Que含量均未在檢出限以上，因此采用加標(biāo)回收試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)表1，Que回收率在90%～114%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.11%～5.7%范圍，表明發(fā)展的方法能夠有效地檢測(cè)樣品中的Que含量。

表1 3種樣品中槲皮素的加標(biāo)回收率(n=3)

3 結(jié)論

成功制備了槲皮素磁性分子印跡聚合物(Que-MMIPs)，其最大吸附容量為4.38 mg/g ，最佳吸附時(shí)間為25 min。與結(jié)構(gòu)類似物蘆丁吸附效果對(duì)比，其表現(xiàn)出較好的特異性吸附，分離因子為4.05。在實(shí)際樣品測(cè)定中，測(cè)得富集后沙棘粉中槲皮素的含量為57 μmol/L ，加標(biāo)樣品的回收率為90%～114%，表明PEG修飾后的Que-MMIPs吸附性能良好，特異性識(shí)別能力較強(qiáng)，故本研究對(duì)天然藥物活性成分在復(fù)雜基質(zhì)中的分離純化具有重要參考意義。