宋 軍， 艾連峰， 王 敬， 張海超*， 霍惠玲， 李研東

(1.河北省林草花卉質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)中心，河北石家莊 050017；2.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北石家莊 050051；3.河北省獸藥監(jiān)察所，河北石家莊 050035)

在我國(guó)畜牧業(yè)持續(xù)發(fā)展的進(jìn)程中，中獸藥制劑因其毒副作用小、價(jià)格低廉一直備受青睞。然而，近年來(lái)中獸藥制劑中經(jīng)常檢出一些禁限用化學(xué)藥物，嚴(yán)重干擾了獸藥市場(chǎng)秩序，也給動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量帶來(lái)安全隱患[1]。硝基呋喃類藥物是一類具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，主要有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，因其價(jià)格低廉療效好曾被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)，以治療由大腸桿菌和沙門氏菌引起的疾病。但由于該類藥物及代謝物對(duì)人體有致癌、致畸胎等副作用，相繼被世界各國(guó)規(guī)定在飼養(yǎng)過(guò)程中禁止使用，并將硝基呋喃代謝物作為非法使用硝基呋喃的殘留標(biāo)志物，而歐盟設(shè)定4個(gè)硝基呋喃代謝物的最低方法檢測(cè)限均為1 μg/kg[2]。有研究表明，低至30 μg/kg的硝基呋喃類藥物也會(huì)造成動(dòng)物源性食品的污染[3]。為從源頭上確保動(dòng)物源性食品安全，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將硝基呋喃類藥物列為獸藥質(zhì)量監(jiān)督抽檢中的重點(diǎn)檢測(cè)項(xiàng)目，但農(nóng)業(yè)部2448號(hào)公告及現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中獸藥制劑中硝基呋喃藥物測(cè)定低限為2 mg/kg[4]，難以滿足監(jiān)管需求。因此，建立一種測(cè)定中獸藥制劑中硝基呋喃類藥物的快速、高靈敏度的分析方法，對(duì)于打擊違法添加、保障中獸藥制劑質(zhì)量具有實(shí)際意義。

硝基呋喃類藥物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[4 - 8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4,9 - 11]，涉及的基質(zhì)多為飼料[4,7]和動(dòng)物源性食品[6,8]。中獸藥制劑采用液相色譜法檢測(cè)易受基質(zhì)影響，不能準(zhǔn)確定性定量，局限性較大。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為一種靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)的分析手段，對(duì)于硝基呋喃類藥物的測(cè)定具有明顯的優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)已報(bào)道獸藥制劑非處方藥物的測(cè)定方法中多未經(jīng)過(guò)凈化，提取液直接上機(jī)測(cè)定[12 - 15]。但中獸藥制劑配方中通常含有多種中藥成分，在生產(chǎn)中需經(jīng)過(guò)煎煮、蒸餾、添加輔料等制作工藝，基質(zhì)復(fù)雜，嚴(yán)重影響了方法的靈敏度和抗干擾性。且提取液不經(jīng)凈化上機(jī)易污染色譜柱和儀器，增加維護(hù)成本。因此，選擇合適的前處理凈化方法顯得尤為重要。PRiME HLB是一種新型的通過(guò)式固相萃取柱，操作簡(jiǎn)便快速，凈化效果好，目前已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性和植物源性基質(zhì)的凈化[16 - 20]，但在中獸藥制劑中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

本文選取清瘟敗毒散、靜呼素和麻杏石甘口服液三種中獸藥制劑為代表性基質(zhì)樣品，重點(diǎn)對(duì)提取溶劑、凈化方式的選擇以及色譜條件的優(yōu)化進(jìn)行了研究論證。最終采用PRiME HLB柱凈化，建立了中獸藥制劑中硝基呋喃類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)，該方法操作簡(jiǎn)單，凈化效果好，適用于大批量中獸藥制劑中硝基呋喃類藥物的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本，島津公司)；KQ-500E超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Sigma 3K-15型離心機(jī)(美國(guó)，Sigma公司)；PT2100型均質(zhì)器(瑞士，KINEMATICA公司)；渦旋混合器(美國(guó)，Scientific Industries)；混合型陽(yáng)離子(MCX)固相萃取柱(150 mg/6mL，美國(guó)Waters公司)；親水親脂型(HLB)固相萃取柱(150 mg/6mL，美國(guó)Waters公司)；PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6mL，美國(guó)Waters公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：呋喃它酮(Furaltadone,FTD)、呋喃唑酮(Furazolidone,FZD)、呋喃妥因(Nitrofurantoin,NFT)、呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ)，均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于97%。色譜純乙腈、甲醇、丙酮購(gòu)自飛世爾試劑公司(美國(guó)賽默飛)。分析純NaCl購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用純水均由美國(guó)Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)，Millipore公司)制得。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取4種硝基呋喃類藥物標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg(折合純度后)，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃下避光保存。根據(jù)需要，準(zhǔn)確移取適量各硝基呋喃標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待用。

1.3 樣品前處理

稱取4 g(精確到0.01 g)混合均勻的試樣，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈渦旋混勻1 min，加入2 g NaCl，超聲提取20 min，在10 000 r/min下離心5 min。上清液待凈化。

將PRiME HLB固相萃取柱置于固相萃取裝置上，取適量上清液于固相萃取柱中，收集5 mL流出液于玻璃試管中，在40 ℃下氮吹至近干，加入甲醇-0.1%甲酸溶液(2∶8，V/V)渦旋混勻30 s溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜條件：Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A為水，B為甲醇；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10%B；0.5～4.0 min，10%～90%B；4.0～5.0 min，90%B；5.0～5.1 min，90%～10%B；5.1～7.0 min，10%B。柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)，正負(fù)離子同時(shí)掃描，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，離子源溫度300 ℃，毛細(xì)管溫度250 ℃，加熱模塊溫度400 ℃，氮?dú)饬魉?.0 L/min，干燥氣流速10.0 L/min，加熱氣流速10.0 L/min。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 4種硝基呋喃類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

中獸藥制劑成分復(fù)雜，參考文獻(xiàn)方法，本文對(duì)乙腈[7]、乙酸乙酯[6]、乙腈-0.1%甲酸溶液(8∶2，V/V)[5]和甲醇-乙腈-水溶液(3∶3∶4，V/V)[11]4種提取溶劑進(jìn)行了比較。以靜呼素(主要成分為溶菌酶，載體為魚(yú)腥草、知母、澤瀉、萊菔子、甘草等)為例，4種目標(biāo)物回收率見(jiàn)表2。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同提取溶劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響很大，4種提取溶劑提取10 ng/mL FTD的基質(zhì)加標(biāo)如圖1所示。從圖中可看出甲醇-乙腈-水溶液(3∶3∶4，V/V/V)提取的雜質(zhì)最多，嚴(yán)重抑制了化合物的離子化效率，甚至導(dǎo)致FTD信噪比小于10，無(wú)法準(zhǔn)確定量。其余3種提取溶劑中乙腈和乙酸乙酯提取的雜質(zhì)最少，乙腈-0.1%甲酸溶液(8∶2，V/V)其次，推測(cè)水相的增加會(huì)提取更多雜質(zhì)，導(dǎo)致提取效率下降。綜合考慮，從提取更多目標(biāo)化合物和更少雜質(zhì)的角度出發(fā)，本文選擇乙腈作為提取溶劑，4個(gè)目標(biāo)物的回收率均超過(guò)80%。

表2 4種提取溶劑對(duì)回收率的影響

圖1 不同提取溶劑對(duì)呋喃它酮基質(zhì)干擾的影響

2.2 凈化方式的選擇

硝基呋喃原藥通常采用HLB[10,11]和MCX[5,7,8]固相萃取柱凈化。本研究首先考察了這2種固相萃取柱對(duì)4種目標(biāo)物加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用MCX柱凈化，只有FZD的回收率可以達(dá)到80%，NFT和NFZ的回收率在50%左右，F(xiàn)TD的回收率僅為30%。而采用HLB凈化，4個(gè)化合物回收率均可達(dá)到70%以上。但考慮到HLB固相萃取柱需要經(jīng)過(guò)溶劑轉(zhuǎn)換、活化、淋洗等步驟，操作復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)。而采用PRiME HLB凈化，回收率也均在70%以上，且該凈化方式提取液可直接上樣，無(wú)需氮吹轉(zhuǎn)化溶液，故最終選用PRiME HLB柱凈化。與傳統(tǒng)HLB固相萃取方式相比，本研究整個(gè)凈化過(guò)程操作簡(jiǎn)便，凈化效果好，適合同時(shí)處理大批量樣品。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

在流動(dòng)相的選擇中考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-5 mmol/L NH4Ac溶液和甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol/L NH4Ac溶液4種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物的影響。結(jié)果表明，甲醇比乙腈更有助于提高FZD的響應(yīng)值。在水中加入NH4Ac后4個(gè)化合物的靈敏度都偏低，再加入0.1%甲酸仍無(wú)改善，所以流動(dòng)相選為甲醇-水。但在定容液中加入適量甲酸后對(duì)NFT和NFZ的靈敏度略有提高，且對(duì)其他兩種物質(zhì)干擾極小，因此選用了甲醇-0.1%甲酸溶液(2∶8,V/V)作為本實(shí)驗(yàn)的定容液。4種硝基呋喃類藥物的定量離子色譜圖如圖2所示。

圖2 4種硝基呋喃藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子色譜圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的中獸藥制劑樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果往往存在著較大影響。本文采用空白基質(zhì)溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線與純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行斜率比較來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。斜率比為0.8～1.2時(shí)，表示基質(zhì)干擾程度較低；斜率比為0.5～0.8或1.2～1.5時(shí)，表示有中等強(qiáng)度的基質(zhì)干擾效應(yīng)；當(dāng)斜率比值小于0.2或大于1.5時(shí)，表示基質(zhì)效應(yīng)干擾強(qiáng)[21]。結(jié)果表明，所選中獸藥基質(zhì)對(duì)NFT的基質(zhì)效應(yīng)影響較小，基質(zhì)效應(yīng)值為0.9～1.1，對(duì)其余3種化合物均中等強(qiáng)度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)值在0.5～0.8之間。因此為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，本研究采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限將清瘟敗毒散、靜呼素、麻杏石甘口服液三種獸藥制劑的陰性空白樣品提取溶液制備系列濃度基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法進(jìn)行分析測(cè)定。以目標(biāo)物濃度(x，ng/mL)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。各組分在相應(yīng)線性范圍內(nèi)，峰面積與濃度成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9958～0.9993，在空白基質(zhì)中添加不同質(zhì)量濃度的待測(cè)物，計(jì)算方法的檢出限(S/N>3)和定量限(S/N>10)，呋喃它酮檢出限為0.4 μg/kg，定量限為為1 μg/kg，呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林的檢出限均為4 μg/kg，定量限為10 μg/kg。各樣品基質(zhì)的線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 不同基質(zhì)中4種呋喃原藥的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

(續(xù)表3)

2.5.2 回收率和精密度將清瘟敗毒散、靜呼素、麻杏石甘口服液的陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每種基質(zhì)分別添加1倍、2倍和10倍定量限3個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行。計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，3種基質(zhì)中各目標(biāo)物的回收率在72.6%～109.7%之間，RSD在3.5%～10.3%范圍。各化合物在靜呼素樣品及加標(biāo)回收樣品中定量離子色譜圖如圖3所示。各樣品基質(zhì)加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表4。

圖3 靜呼素樣品(a)和添加硝基呋喃類藥物(b)的定量離子色譜圖

表4 4種硝基呋喃類藥物加標(biāo)的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

(續(xù)表4)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

為評(píng)價(jià)該方法的有效性，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定隨機(jī)送檢的止瘧散、清瘟敗毒散等20份中獸藥制劑樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

3 結(jié)論

本方法應(yīng)用PRiME HLB固相萃取柱凈化，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測(cè)技術(shù)，建立了中獸藥制劑中4種硝基呋喃類藥物的檢測(cè)方法。本方法與傳統(tǒng)凈化方式相比，簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程、提高了工作效率。該方法適用于大批量中獸藥制劑中4種硝基呋喃類藥物的測(cè)定。