何榮桓， 王佳怡, 郭鵬飛, 陳明麗

(東北大學理學院化學系,遼寧沈陽 110819)

蛋白質(zhì)作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動的重要承擔者，其對生命體中的代謝催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、協(xié)調(diào)運動以及生長與發(fā)育的控制均發(fā)揮著非常重要的作用[1]。將蛋白質(zhì)從復雜生命體中分離出來，并進行后續(xù)的結(jié)構(gòu)及功能研究，對于理解生命活動的規(guī)律和闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)具有重要意義。固相萃取是蛋白質(zhì)分離富集的重要手段，其操作簡單快速，吸附分離效率高[2]。因此，發(fā)展新型有效的固相萃取材料，是蛋白質(zhì)分離富集研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

眾所周知，多孔材料具有較大的比表面積，固有的孔隙率和豐富的合成后修飾結(jié)合位點，使其成為吸附蛋白質(zhì)及其他物種的有效候選材料。其中共價有機框架(COFs)作為一種具有強共價鍵的新型晶體有機聚合物，自被報道以來引發(fā)了大量相關(guān)研究[3]。COFs的特定結(jié)構(gòu)使其具有顯著特點，即孔道規(guī)整、易于官能團化、合成單體廣泛、連接方式多樣化、性質(zhì)穩(wěn)定等[4]。靈活多樣的功能化及物理化學性能調(diào)控，使其在蛋白質(zhì)的分離富集領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。研究發(fā)現(xiàn)COFs難以從溶液中快速分離出來，從而影響其在實際固相萃取中的分離富集效率，而磁性納米載體則可有效地解決其相分離的問題[5]。本文采用超聲合成法，在常溫常壓下制備了一種可在溶液條件下穩(wěn)定存在的亞胺型COFs載體[6]。將COFs負載于Fe3O4表面，得到了一種磁性Fe3O4@COF復合材料。其中，具有超順磁性的Fe3O4磁性納米粒子可快速對外界磁場產(chǎn)生響應，從而提高吸附分離與富集效率。在pH=5及離子強度為0.4 mol/L NaCl溶液的條件下，F(xiàn)e3O4@COF復合材料可有效吸附卵清蛋白，并具有較高的吸附容量。將其應用于蛋清中卵清蛋白(Ovalbumin,Ova)的分離富集與純化，得到了滿意的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳槽、雙垂直電泳儀DYCZ-24EN電泳槽、DYY-26C電泳儀電源和鐘擺式脫色搖床(北京六一生物科技有限公司)；ZEISS Ultra/Plus型掃描電子顯微鏡(德國，ZEISS公司)；Oxford X-MaxN 50 EDS能譜分析儀(英國，Oxford公司)；Tanon 4600 SF全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀(上海天能科技有限公司)；U-3900型紫外-可見分光光度計(日本，Hitachi公司)；Nicolet-6700傅里葉變換紅外光譜儀(美國，賽默飛公司)；Nano-ZS90激光粒度儀(英國，Malvern公司)。

三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸(大連美侖生物公司)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甲醇、四氫呋喃、十二烷基硫酸鈉(SDS)和過硫酸銨(上海阿拉丁試劑有限公司)；檸檬酸鈉(天津博迪化工有限公司)；無水NaAc、咪唑、乙二醇、HCl、H3PO4、TEMED(國藥集團化學試劑有限公司)；檸檬酸三鈉、NaCl、FeCl3、冰HAc(天津大茂化學試劑廠)；聯(lián)苯胺(北京市東環(huán)聯(lián)合化工廠)；1,4-二氧六環(huán)、1,3,5-三甲基苯、丙酮(沈陽萊博科貿(mào)有限公司)；考馬斯亮藍G250(上海博奧試劑有限公司)。水為去離子水。

1.2 磁性復合材料的制備

1.2.1 Fe3O4的水熱法合成采用文獻方法[7]合成Fe3O4，具體步驟如下：將FeCl3(1.4 g)與檸檬酸鈉(0.4 g)及NaAc(3.8 g)溶解于70 mL乙二醇中，超聲10 min分散均勻，然后在80 ℃下機械攪拌1 h，將所得混合物轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應釜中在200 ℃反應16 h。反應結(jié)束后將混合物冷卻至室溫，依次用去離子水和乙醇洗滌合成產(chǎn)物3次，將所得固體在60 ℃真空干燥8 h,即得Fe3O4。

1.2.2 Fe3O4@COF復合物的超聲法制備在文獻方法[8]的基礎(chǔ)上，采用超聲法制備Fe3O4@COF復合材料，具體步驟為：將Fe3O4(150 mg)、1,3,5-三甲酰基間苯三酚(21 mg)、聯(lián)苯胺(27 mg)分散于3 mL二氧六環(huán)、3 mL均三甲苯及0.5 mL(3 mol/L)HAc的混合溶劑中，超聲1 h后，加入40 mL四氫呋喃，繼續(xù)超聲30 min。然后浸泡24 h，將所得產(chǎn)物用DMF和丙酮依次清洗3次，將所得復合材料在65 ℃真空干燥10 h，即得Fe3O4@COF。

1.3 Fe3O4@COF復合物對蛋白質(zhì)的吸附性能研究

1.3.1 pH值及離子強度的影響稱取1 mg Fe3O4@COF，置于1.5 mL離心管中，向其中加入1 mL 100 μg/mL的卵清蛋白溶液(分別用pH=3、4、5、7、9的緩沖溶液配制)，吸附時間設(shè)定為30 min。吸附后，測定不同pH值條件下的吸附率。

向100 μg/mL卵清蛋白溶液(pH=5.0)中加入不同濃度NaCl溶液，與1 mg Fe3O4@COF復合物振蕩吸附30 min，吸附結(jié)束后進行磁性分離，測定不同NaCl濃度下的吸附率。

1.3.2 吸附容量的測定在最佳pH和離子強度條件下，將1 mg的Fe3O4@COF復合材料，分別加入50、100、200、400、800、1 000 μg/mL的卵清蛋白溶液中進行吸附實驗。吸附結(jié)束后，按照下列公式計算Fe3O4@COF 復合物對不同初始濃度卵清蛋白的吸附量(Q)。

(1)

式中，c0為吸附溶液初始濃度；c1為平衡后吸附上清液的濃度；V為吸附溶液體積；m為固體吸附劑質(zhì)量。

1.3.3 卵清蛋白的洗脫與回收為了有效洗脫與回收吸附在Fe3O4@COF復合物表面的卵清蛋白，對可能的洗脫劑進行了選擇預實驗。分別選擇0.1%的SDS、0.1 mol/L的Tris和0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=5)作為洗脫劑，在最佳吸附條件下對卵清蛋白進行吸附后，移除上清液，并分別加入1 mL 以上洗脫劑，將洗脫時間設(shè)定為30 min進行洗脫回收，測定洗脫回收率。

1.4 實際樣品中卵清蛋白的洗脫回收

取新鮮雞蛋清10 μL，用0.4 mol/L的緩沖溶液(pH=5.0)稀釋100倍，經(jīng)5 000 r/min離心除去雜質(zhì)。移取1 mg Fe3O4@COF復合材料，向其中加入1 mL蛋清稀釋溶液，振蕩吸附30 min后，磁分離。取上清液加入1 mL 0.1%SDS溶液，振蕩30 min以洗脫吸附的卵清蛋白，得到純化的卵清蛋白溶液，并對其進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@COF復合材料的表征

2.1.1 化學結(jié)構(gòu)分析紅外光譜分析的結(jié)果表明，位于630 cm-1和1 612 cm-1的吸收峰分別對應Fe3O4中的Fe-O伸縮振動[9]及其表面殘留的-COOH；3 425 cm-1對應H-O-H的非對稱伸縮振動峰,是由于Fe3O4中殘留的水分引起的。在Fe3O4@COF復合材料中,630 cm-1的峰強度相比于Fe3O4明顯減小，證明Fe3O4被成功包覆。另外，在1 586 cm-1和1 452 cm-1處出現(xiàn)的新吸收峰為苯環(huán)的呼吸特征峰，而1 288 cm-1及1 091 cm-1為C-N和C-O等單鍵的伸縮振動峰，997 cm-1及816 cm-1為烯烴面外彎曲振動峰。上述實驗事實說明COFs已被固載于Fe3O4粒子表面。

2.1.2 形貌與元素分析圖1A和1B中Fe3O4和Fe3O4@COF復合材料的掃描電子顯微鏡(SEM)圖顯示其均為球形且單一分散。另外，通過對比Fe3O4和Fe3O4@COF的形貌,可以發(fā)現(xiàn)在修飾COFs之前,Fe3O4表面相對平整，而由于修飾COFs導致其表面變得粗糙不平，出現(xiàn)了許多突起，證明了COFs已成功包裹于Fe3O4表面。圖1C和1D中的能譜(EDS)給出了Fe3O4以及Fe3O4@COF中的元素分析結(jié)果，顯而易見，與Fe3O4相比，F(xiàn)e3O4@COF表面出現(xiàn)了非常明顯的C元素和N元素峰，此結(jié)果可進一步說明COFs已固載/包裹于Fe3O4的表面。

圖1 (A)Fe3O4的掃描電鏡(SEM)圖；(B)Fe3O4@COF的SEM圖；(C)Fe3O4的EDS能譜(EDS)圖；(D)Fe3O4@-COF的EDS譜圖

2.1.3 表面電荷性能分析Zeta電位是帶電固體與液體介質(zhì)相對運動時,實際運動界面與液體內(nèi)部的電位差。由于顆粒表面帶電,可通過庫侖力與其他作用力吸引周圍帶有相反電荷的離子構(gòu)成緊密層。在緊密層之外,溶液中的正負離子由于靜電排斥和熱運動而形成擴散層,緊密層與擴散層則構(gòu)成雙電層。固體顆粒表面吸附的水分子膜與水化分子構(gòu)成固定層，與雙電層之間形成剪切面，剪切面相對于電介質(zhì)本體處的電位差即為Zeta電位，其可以有效的表明固體表面的電荷性能。由圖2可知，F(xiàn)e3O4和Fe3O4@COF在pH=3～9的范圍內(nèi)表面均帶負電，并且在修飾COFs后，由于材料表面苯環(huán)、C-N以及C=C等官能團的比例增加，使得Fe3O4@COF復合材料相較于Fe3O4電負性減弱。這表明修飾COFs后，材料表面性能得到了明顯改變。

圖2 Fe3O4和Fe3O4@COF復合物表面的Zeta電位變化趨勢圖

2.2 Fe3O4@COF復合材料對卵清蛋白的吸附性能

2.2.1 pH對卵清蛋白吸附的影響不同pH條件下，F(xiàn)e3O4@COF復合材料對卵清蛋白的吸附情況如圖3所示。隨著溶液pH增大(pH=3～5)，卵清蛋白的吸附增加，在pH=5時吸附率最高。隨pH繼續(xù)增加(pH=5～9),卵清蛋白的吸附效率降低。卵清蛋白是一種糖蛋白[10],其等電點為pI=4.5,在其天冬酰胺殘基的位置上與一個由3個N-乙酰葡糖胺、5個甘露糖殘基組成的寡糖形成溶劑暴露的N-糖苷鍵[11]。所以卵清蛋白中含有寡糖鏈，表面存在較多羥基，可與COFs中的O、N等原子形成氫鍵。隨pH增大，卵清蛋白表面羥基質(zhì)子化的程度變?nèi)?，導致以氫鍵結(jié)合形式吸附的蛋白質(zhì)增加；同時，在pH=3～4.5時，卵清蛋白表面帶正電荷，其與Fe3O4@COF復合材料發(fā)生靜電吸引而被吸附到Fe3O4@COF載體上。當pH>5時，卵清蛋白表面失去質(zhì)子帶有負電荷，因此導致靜電吸附效率降低。

圖3 pH對卵清蛋白在Fe3O4@COF復合物表面吸附效率的影響

2.2.2 離子強度對卵清蛋白吸附的影響通過研究pH對Fe3O4@COF復合物吸附卵清蛋白的影響可知,氫鍵與靜電作用是該復合物吸附卵清蛋白的主要驅(qū)動力。為此，選擇pH=5.0，考察離子強度變化對Fe3O4@COF復合材料吸附卵清蛋白的影響，離子強度的變化通過改變?nèi)芤褐蠳aCl的濃度予以實現(xiàn)。如圖4所示，在離子強度較低時(<0.4 mol/L)，隨NaCl濃度增大，卵清蛋白的吸附效率增加。這可能是由于NaCl濃度增大導致離子的水化作用增強而使水分子離開蛋白，蛋白質(zhì)裸露出來致使吸附載體的結(jié)合增強，從而導致吸附效率出現(xiàn)增高的趨勢。隨著離子強度繼續(xù)增大(>0.4 mol/L),吸附率開始下降，溶液中高濃度的NaCl與蛋白質(zhì)在Fe3O4@COF復合材料表面的競爭吸附作用增強，導致吸附效率呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖4 離子強度對卵清蛋白在Fe3O4@COF復合物表面吸附效率的影響(pH-5.0)

2.2.3 吸附容量研究表明，隨著卵清蛋白濃度增大,Fe3O4@COF復合材料對其吸附量逐漸增大，這是由于在蛋白質(zhì)濃度較低時,Fe3O4@COF復合材料具備充足的吸附位點，可吸附溶液中所有的蛋白質(zhì)。而當?shù)鞍踪|(zhì)濃度增加到一定程度時，隨著蛋白質(zhì)初始濃度的增大，其吸附的增加趨勢變緩，直至達到平臺區(qū)。根據(jù)卵清蛋白的吸附等溫線，由1/Qe對1/ce的線性關(guān)系(ce和Qe分別為液相及固相中蛋白質(zhì)的濃度),得到擬合線性方程：1/Qe=0.05857/ce+0.00227。說明Fe3O4@COF復合材料對卵清蛋白的吸附行為符合Langmuir等溫式吸附，并可判斷Fe3O4@COF復合物對卵清蛋白的吸附為單分子層吸附。同時得到吸附容量Qmax為440.5 μg/mg。

2.2.4 卵清蛋白的洗脫與回收卵清蛋白被Fe3O4@-COF復合材料吸附后，需要將其洗脫并回收，轉(zhuǎn)入水相中以利于后續(xù)的研究。為此，我們考察了3種常用洗脫劑對卵清蛋白的洗脫與回收效果。洗脫劑分別為SDS(0.1%)、Tris(0.1 mol/L)、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH=5)。實驗結(jié)果表明，這些洗脫劑均可一定程度的從Fe3O4@COF復合材料上洗脫回收卵清蛋白，其中0.1%SDS和0.1 mol/L Tri的洗脫效果更佳，其對卵清蛋白的洗脫回收效率分別為84%和95%。

2.3 實際樣品中卵清蛋白的吸附分離

按照前述實驗方法和條件，將Fe3O4@COF復合材料應用于雞蛋清中卵清蛋白的分離與純化，經(jīng)SDS-PAGE分析的結(jié)果如圖5所示。很顯然，經(jīng)吸附分離后從蛋清樣品中得到6.5～200 kDa范圍內(nèi)的幾條明顯的條帶(泳道b)，分別對應樣品中的伴白蛋白(77.7 kDa)、卵清蛋白(45 kDa)以及溶菌酶(14.3 kDa)。經(jīng)過Fe3O4@COF復合材料吸附分離后，在上清液中這些條帶依然清晰地存在，只是條帶的顏色變淺(泳道c)。這是由于樣品中這些蛋白的濃度很高，1 mg Fe3O4@COF復合材料吸附后只能去除一部分，但是不可能完全吸附。而經(jīng)0.1%SDS洗脫后，洗脫液在44.3 kDa處有一個明顯條帶(泳道d),該條帶與卵清蛋白條帶位置一致(泳道e)，這是洗脫回收得到的卵清蛋白。該條帶還有一條伴生條帶，這是由于卵清蛋白屬于球狀蛋白,其在某一pH和鹽濃度條件下可以形成兩種微結(jié)構(gòu)所致[12]。

圖5 有關(guān)樣品及洗脫液中蛋白質(zhì)的SDS -聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳譜圖。(a)蛋白Marker(kDa)；(b)100倍稀釋的蛋清液；(c)100倍稀釋的蛋清液經(jīng)Fe3O4@COF復合物吸附后的上清液；(d)經(jīng)Fe3O4@COF復合物吸附后又經(jīng)0.1%SDS洗脫回收的卵清蛋白溶液；(e)卵清蛋白標準溶液(100 μg/mL)。

3 結(jié)論

本文采用超聲合成法制備了一種磁性Fe3O4@COF復合材料。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4@COF復合材料為球形形貌，且具有良好的單分散性且其粒徑均一。Fe3O4@COF復合材料在一定條件下可以有效地吸附分離卵清蛋白。蛋清中的卵清蛋白被Fe3O4@COF復合材料吸附后，還可以方便地用0.1%的SDS或0.1 mol/L的Tris緩沖溶液進行有效地洗脫回收。說明磁性共價有機框架復合材料可作為蛋白質(zhì)分離富集新的吸附載體，可據(jù)以設(shè)計并調(diào)控對特定蛋白質(zhì)的吸附與分離。