溫 娜， 張國梅*， 李德芳， 吳鈺周， 雙少敏*

(1.山西大學化學化工學院，山西太原 030006;2.華中科技大學化學化工學院，湖北武漢 430074)

維生素B12(VB12)又叫鈷胺素，它是一種水溶性維生素。自然界中的VB12都是微生物合成的。動物源性食物中基本上沒有維生素B12，而動物內(nèi)臟、肉類、蛋類是VB12的主要來源。VB12可以有效地預防惡性貧血、老年癡呆、抑郁癥等[1]疾病。VB12缺乏會導致貧血、心血管疾病和神經(jīng)損傷，但過量的VB12也會產(chǎn)生副作用，例如引起肝病和腎衰竭。因此，建立一種檢測VB12的方法非常重要。目前檢測VB12的方法有高效液相色譜、質(zhì)譜、毛細管電泳[2 - 5]等方法。但是這些方法需要昂貴的設備，較長的反應時間和復雜的樣品預處理。因此尋求一種簡便快速檢測VB12的方法是必要的。近年來，隨著納米材料的發(fā)展，一些納米材料已被廣泛應用于檢測VB12，例如有機染料[6]、碳點(CDs)[7,8]。Yu等[9]以氨基丙基三氧硅烷作為碳源，檸檬酸鈉作為還原劑合成的硅量子點((SiQDs)檢測VB12，方法的線性范圍為0.5～16.0 μmol·L-1，檢出限為158 nmol·L-1。Dong等[10]以蔗糖、H3PO4和1,2-乙二胺(EDA)為碳源，制備磷氮雙摻雜碳點(PN-CDs)來檢測VB12。

金屬納米簇由于具有水溶性好、毒性小和生物相容性好等優(yōu)點被用作新型的熒光納米材料[11]。這些優(yōu)越的特性表明了納米簇在化學傳感、生物傳感和催化劑等方面的突出優(yōu)勢。但到目前為止，沒有以乙醇作為溶劑合成納米簇用于VB12檢測的報道。在本工作中，以多巴胺(DA)作為保護劑,NaBH4作為還原劑，乙醇作為溶劑，采用一鍋法合成了多巴胺保護的銀納米簇(DA@Ag NCs)，而VB12可以有效地猝滅DA@Ag NCs的熒光，因此DA@Ag NCs可以作為熒光探針檢測VB12。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本，電子株式會社)；X射線光電子能譜儀(英國，Kratos公司)；F-4500熒光分光光度計(日本，日立公司)；UV-2910紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；BS124S電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

鹽酸多巴胺、AgNO3、NaBH4購買于上海麥克林生化科技有限公司；NaOH購買于天津市風船化學試劑科技有限公司。實驗用水為Milli-Q超純水(>18.2 MΩ·cm)。

1.2 DA@Ag NCs的合成

DA@Ag NCs的合成路線如圖1所示。

圖1 DA@Ag NCs的合成示意圖

將4 mL 10 mmol/L的DA在攪拌中加入到1 mL 10 mmol/L的AgNO3溶液中。室溫下繼續(xù)攪拌10 min,然后加入150 μL 1 mol/L的NaOH溶液，溶液由無色變?yōu)樯钭厣芤?，繼續(xù)攪拌5 min后，加入100 μL 1 mol/L的NaBH4溶液，在55 ℃水浴中反應10 h,得到了黃色的DA@Ag NCs溶液。將該溶液靜置一段時間，離心5 min后移出溶液，將DA@Ag NCs溶液放在冰箱中冷藏保存，備用。

1.3 pH值的優(yōu)化

將100 μL DA@Ag NCs溶液，10 μL VB12溶液和890 μL不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)混合于比色皿中，2 min后，在激發(fā)波長468 nm處測量熒光強度(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm)。

1.4 VB12的檢測

將100 μL DA@Ag NCs溶液，300 μL超純水和600 μL PBS混合于比色皿中，然后加入不同濃度的VB12溶液,反應2 min后，在激發(fā)波長468 nm處測量熒光強度。

2 結果與討論

2.1 DA@Ag NCs的表征

圖2(A)為DA@Ag NCs的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜圖，其熒光最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為458 nm和536 nm。插圖中DA@Ag NCs在日光下呈黃色，在365 nm的紫外波長線燈下呈綠色。圖2(B)為純DA與DA@Ag NCs的紫外-可見吸收光譜，與DA相比，DA@Ag NCs在約280 nm波長處出現(xiàn)明顯的吸收峰，可以進一步說明合成了DA@Ag NCs。

X射線光電子能譜(XPS)全譜圖提供了合成的Ag NCs的組成，如圖2(C)所示，表明DA@Ag NCs中含有C、O、N、Ag等元素。圖2(D)為Ag 3d的XPS譜圖，Ag 3d5/2的結合能為368 eV,為Ag(0)的特征吸收峰，表明Ag NCs中存在Ag(0)[12]。

圖2(E)為Ag NCs的透射電鏡(TEM)圖，從圖中可以看出Ag NCs外觀類似球形，分散性較好，粒徑分布均勻，粒徑大約在2.61 nm。圖2(F)為DA和DA@Ag NCs的紅外(IR)光譜圖，由圖中可知3 500～3 200 cm-1為羥基/氨基的伸縮振動，3 072 cm-1為苯環(huán)上C-H鍵的伸縮振動，879 cm-1、817 cm-1為苯環(huán)取代基的特征吸收峰，1 619 cm-1和1 503 cm-1分別為N-H的彎曲振動和苯環(huán)上C=C振動。而在DA@Ag NCs中這兩個特征峰則出現(xiàn)在1 602 cm-1、1 494 cm-1，并且苯環(huán)取代基的特征吸收峰消失，這可能是因為DA與AgNO3之間發(fā)生了反應。

圖2 (A)DA@Ag NCs的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜圖(插圖為DA@Ag NCs在日光下的照片(左)和365 nm紫外燈下的照片(右));(B)DA與DA@Ag NCs的紫外-可見吸收光譜；(C)Ag NCs的X射線光電子能譜(XPS)全譜圖;(D)Ag NCs中Ag 3d的XPS譜圖；(E)DA@Ag NCs的透射電鏡(TEM)圖和粒徑分布圖；(F)DA@Ag NCs和DA的紅外(IR)光譜圖

2.2 DA@Ag NCs在不同溶劑中的熒光性能分析

對合成的DA@Ag NCs在不同溶劑，如甲醇、乙醇、DMF等中的熒光性能進行研究。結果表明：隨著有機溶劑體積分數(shù)的增加，DA@Ag NCs的熒光強度逐漸增強。如圖3(A)所示，隨著乙醇體積分數(shù)增加，DA@Ag NCs熒光光譜峰形沒有發(fā)生變化，但熒光強度不斷增加?；诖?，用乙醇為溶劑合成Ag NCs的熒光效率大大增強。圖3(B)為乙醇為溶劑合成的Ag NCs，及以水為溶劑合成的Ag NCs熒光光譜圖。與水相比，以乙醇為溶劑時其熒光強度約增大10倍。以香豆素307(量子產(chǎn)率為0.56)為參比，DA@Ag NCs的量子產(chǎn)率為6.8%。

圖3 (A)DA@Ag NCs在不同含量的乙醇溶液中的熒光光譜圖；(B)以水為溶劑合成的DA@Ag NCs和以乙醇為溶劑合成的DA@Ag NCs的熒光光譜圖

2.3 DA@Ag NCs熒光猝滅和選擇性實驗

優(yōu)化實驗條件，探索VB12誘導DA@Ag NCs熒光猝滅的實驗，如圖4(A)所示，隨著VB12的濃度從0 μmol/L增加到80 μmol，DA@Ag NCs熒光強度逐漸減弱。在458 nm處F/F0值(F0和F分別代表不存在和存在VB12時Ag NCs的熒光強度)逐漸降低，并在5～80 μmol/L濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程為：F/F0=0.9530+0.0089c(R2=0.9910)，檢出限(S/N=3)為588 nmol/L。線性關系如圖4(B)所示。

在相同的實驗條件下，考察DA@Ag NCs對VB12的選擇性。實驗考察了VB1、VB3、VB6、VB7、VB9、VC、脯氨酸、蘇氨酸、組氨酸、谷氨基酸、天冬酰胺、纈氨酸、苯丙氨酸、Al3+、Hg2+、Cr3+、Ag+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Pb2+、Co2+和Fe2+對DA@Ag NCs的響應。如圖4(C)和4(D)所示：加入VB12后的DA@Ag NCs熒光發(fā)生明顯的猝滅，而所考察的維生素和氨基酸，以及金屬陽離子對DA@Ag NCs的熒光強度幾乎沒影響，可見DA@Ag NCs對VB12有較高的選擇性。

圖4 (A)不同濃度VB12(0～80 μmol/L)對DA@Ag NCs熒光光譜的影響；(B)DA@Ag NCs熒光強度比值(F/F0)與VB12濃度的線性曲線圖；(C)DA@Ag NCs對不同小分子的響應；(D)DA@Ag NCs對不同金屬離子的響應

如表1所示，通過與其他檢測VB12的方法相比，該方法檢測VB12具有較寬的線性范圍。

表1 DA@Ag NCs與不同熒光納米材料的檢測VB12方法的比較

2.4 VB12對DA@Ag NCs猝滅機理

圖5(A)所示為VB12的紫外-可見吸收光譜和DA@Ag NCs的熒光發(fā)射光譜，從圖中可以看出VB12的吸收光譜與DA@Ag NCs的熒光發(fā)射光譜有很大程度的重疊，說明熒光強度下降可能是由內(nèi)濾效應引起的。為了進一步探究猝滅機理，測量了VB12濃度對納米簇壽命的影響。如圖5(B)所示，發(fā)現(xiàn)加入VB12后DA@Ag NCs的熒光壽命幾乎沒有變化，進一步說明DA@Ag NCs的熒光猝滅是由內(nèi)濾效應引起。

圖5 (A)VB12的紫外-可見光譜圖和Ag NCs的發(fā)射光譜圖；(B)DA@Ag NCs和DA@Ag NCs-VB12的熒光壽命

2.5 實際樣品中VB12的檢測

為了評估DA@Ag NCs在實際樣品中對VB12檢測的可行性，測定了藥片、滴眼液中VB12的含量。采用加標回收法，結果如表2所示，測定的回收率在98.17%～100.93%范圍，相對標準偏差(RSD)小于3.0%，說明DA@Ag NCs可用于實際樣品的測定。

表2 實際樣品中VB12的測定結果

3 結論

在本研究中，以一種簡單易得的方法合成了Ag NCs。此外，由于乙醇特殊的溶劑效應使Ag NCs的熒光強度極大增強，因此選用乙醇作為溶劑合成發(fā)光效率高的Ag NCs。由于VB12能有效猝滅Ag NCs的熒光，且在5～80 μmol/L呈良好的線性關系，成功建立了基于Ag NCs的熒光猝滅法測定VB12，并用于實際樣品的檢測，結果較好。