孟冬玲， 王維剛, 溫佳琦， 嚴 俊， 李秋蘭， 周 蕓， 陳志燕*

(1.廣西中煙工業(yè)有限責任公司，廣西南寧 530001;2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500)

食品香精是通過多種香料、適量溶劑以及其它成分調(diào)配而成的混合物，在食品加工過程中可直接添加，并能起到改善口感、提升品質(zhì)等作用。在香料中，添加抗氧化劑可有效延緩香精的氧化速度[1]。其中，特丁基對苯二酚(TBHQ)是食品香精中比較常見的一種抗氧化劑，與傳統(tǒng)的丁基羥基茴香醚、2,6-二丁基羥基甲苯等抗氧化劑相比，其抗氧化性能更強；另外TBHQ熱穩(wěn)定性好，添加在香料中無任何異味。但有研究表明食用過量的合成抗氧化劑，在某種程度上會對人體健康造成一定損害[2 - 4]。因此，大多數(shù)國家和地區(qū)都對食品中合成抗氧化劑的添加量做出了嚴格的規(guī)定和控制，我國國家標準(GB 2760-2014)[5]中也對合成類抗氧化劑的使用量做出了明確規(guī)定。TBHQ常見的檢測方法有比色法[6]、熒光法[7,8]、液相色譜法[9]、氣相色譜法[10]、電化學(xué)方法[11]等。其中，比色法由于操作簡單、快速、不需要使用大型儀器設(shè)備，因而應(yīng)用最為廣泛。但由于其特性差、檢測干擾嚴重，導(dǎo)致其在檢測中存在很多的局限性。

納米酶是一類具有生物催化活性的納米材料，因可以模擬天然酶而被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域。Mn3O4顆粒具有類似酶活性，作為模擬酶也引起越來越多的關(guān)注。有研究表明，Mn3O4納米酶中存在的Mn3+/Mn2+使其具有良好的氧化還原能力，已有研究將其用于一些氧化還原反應(yīng)中[12，13]，并表現(xiàn)出好的氧化酶催化活性[14]。本文先以碘、銅摻雜碳點(Cu-I/CDs)作為還原劑，聚丙烯亞胺為保護劑，制備得到金納米粒子(Au NPs)。將Mn3O4納米酶與Au NPs復(fù)配，制得Mn3O4/Au復(fù)合納米酶，并研究了Au NPs的加入對底物TBHQ的催化效果?；趶?fù)合納米酶催化氧化TBHQ生成紅色醌類化合物TQ(圖1)，建立高選擇性檢測TBHQ的新方法。與其它研究不同的是，該研究體系對TBHQ具有非常好的選擇性，可以有效避免實際樣品中共存物質(zhì)的干擾，如同類合成酚類抗氧化劑、氨基酸、糖等。

圖1 氧化催化TBQH產(chǎn)生紅色TQ

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2600紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；Tcnai G2 TF30場發(fā)射透射電子顯微鏡(荷蘭，F(xiàn)EI公司)；D8Venture X射線衍射儀(德國，Bruker公司)；TENsoR27傅立葉紅外光譜分析儀(德國，Bmker公司)；ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀(美國，Thermo Fisher公司)。

標準品：3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、沒食子酸丙酯(PG)、丁基羥基茴香醚(BHA)、二叔丁基對甲酚(BHT)，均購于上海國藥集團(純度≥99%)；其它試劑均為分析純。實驗用水為去離子水(18.25 MΩ·cm)。

香精樣品均為市售。

1.2 Mn3O4/Au復(fù)合納米酶的制備

Mn3O4納米材料制備參考文獻方法[15]。稱取0.2 g MnSO4溶于200 mL去離子水中，然后轉(zhuǎn)移至250 mL三頸燒瓶中，劇烈攪拌下加入1.35 g尿素，1.2 g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，在85 ℃下攪拌24 h。冷卻至室溫后，劇烈攪拌下加入10 mL 20%NaOH溶液，5 min后再緩慢滴加15 mL 30%H2O2，混合溶液靜置24 h。離心(8 000 r/min，5 min)后，所得沉淀用水和乙醇交替洗滌(2～3次)后干燥。最后置于馬弗爐中400 ℃灼燒4 h，得到Mn3O4納米材料。

Cu-I/CDs的制備：0.1 g CuCl2和0.4 g 3-碘-L-酪氨酸溶于40 mL去離子水中后，加入100 μL乙二胺，超聲10 min。將溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜，于180 ℃加熱8 h。反應(yīng)結(jié)束自然冷卻后，先用孔徑0.22 μm濾膜過濾，再用截留分子量為3 000 D透析袋透析處理24 h，即得還原性Cu-I/CDs。

Au NPs的制備：將2 mL聚乙烯亞胺(250 g/L)加入到20 mL去離子水中，攪拌下加入1%HAuCl4溶液80 μL，繼續(xù)攪拌3 min。然后加入200 μL Cu-I/CDs，攪拌30 min后，溶液變?yōu)榧t褐色，即得經(jīng)Cu-I/CDs還原的Au NPs。

復(fù)合納米酶的制備：取10 mL Mn3O4(1 mg/mL)和2 mL Au NPs，攪拌30 min之后，即得Mn3O4/Au復(fù)合納米酶。

1.3 Mn3O4/Au復(fù)合納米酶活性的考察

取10 μL不同濃度的Mn3O4/Au溶液、20 μL的TMB溶液(0.01 mol/L)和40 μL檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液(pH=4.0)，置于15 mL離心管中，制成樣品溶液(定容至100 μL)。將樣品溶液混勻后，于室溫下反應(yīng)20 min后，測量樣品溶液在波長650 nm處的吸光度。

1.4 Mn3O4/Au復(fù)合納米酶測定TBHQ的含量

在10 mL具塞比色管中，依次加100 μL 0.01 g/L Mn3O4/Au溶液和不同體積的10 mg/kg TBHQ溶液，使用檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至7.4后，于室溫(25 ℃)反應(yīng)10 min，在波長492 nm處測量吸光度。每組樣品平行測定3次，取平均值。

1.5 香精香料樣品的前處理

準確吸取2.0 mL香精香料樣品，置于25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度。超聲提取30 min后，使用定性濾紙過濾，即得到樣品提取液。

2 結(jié)果與討論

2.1 Mn3O4/Au復(fù)合納米酶的表征

如圖2A所示，通過透射電鏡(TEM)可以觀察到Mn3O4/Au納米粒子的微觀形貌，所制得的Mn3O4/Au呈現(xiàn)近球形顆粒，尺寸在20 nm左右，分布較為均勻。圖2B為Mn3O4/Au的高分辨透射電鏡(HRTEM)圖，顯示Mn3O4/Au的晶格間距為0.223 nm，這與文獻報道的Mn3O4類顆粒的晶格相一致[14]。

為了證明Mn3O4/Au結(jié)晶結(jié)構(gòu)，采用X射線衍射(XRD)對材料做進一步的表征。如圖2C所示，所制備的Mn3O4/Au的衍射角2θ在18.1°至64.8°的范圍內(nèi)，分別對應(yīng)Mn3O4(黑色)不同的晶面(101)、(112)、(200)、(103)、(211)、(004)、(220)、(105)、(312)、(303)、(321)、(224)和(400)，對應(yīng)于Au(藍色)的晶面有(111)、(200)、(220)[16,17]。

圖2 Mn3O4/Au復(fù)合納米酶的透射電鏡(TEM)圖(A)、高分辨透射電鏡(HRTEM)圖(B)和X射線衍射(XRD)圖(C)

Mn3O4/Au復(fù)合納米酶的X射線光電子能譜(XPS)全譜圖表明所合成的納米材料主要由C、O、Mn、Au等元素組成(圖3A)。其中，Mn 2p在653.28 eV和641.82 eV處顯示的兩個特征峰，分別對應(yīng)Mn 2p1/2和Mn 2p3/2自旋軌道分裂峰，其結(jié)合能差為11.46 eV[15]。通過進行曲線擬合解旋，Mn 2p3/2峰可進一步分為Mn2+、Mn3+、Mn4+三組峰，其結(jié)合能分別為641.4、642.6和645.3 eV(圖3B)[15]。Au在Mn3O4/Au中的XPS(圖3C)的兩個結(jié)合能，分別為82.8 eV和87.5 eV，對應(yīng)于Au(0) 4f7/2和Au(0) 4f5/2軌道[18]。

圖3 Mn3O4/Au復(fù)核氧化酶的XPS圖譜(A)；Mn3O4/Au中Mn 2p(B)和Au 4f(C)的高分辨率XPS圖譜

2.2 Mn3O4/Au復(fù)合納米酶活性研究

米氏動力學(xué)常數(shù)(Km)表示酶對于底物的親和能力，Km值越小，說明酶和底物的結(jié)合能力越強。其中Km可以通過Lineweaver-Bur曲線：1/v=(Km/vmax)×(1/[S])+1/vmax獲得(圖4)[19]。式中v、vmax、S和Km分別代表反應(yīng)速率、最大反應(yīng)速率、底物濃度和米氏常數(shù)。在最優(yōu)條件下，Mn3O4/Au對底物TMB的vmax=0.818(10-8mol/(L·s))，Km=0.094 mmol/L；對底物H2O2的vmax=1.263(10-8mol/(L·s))，Km=0.53 mmol/L(表1)。與天然酶HRP催化TMB及H2O2相比，Mn3O4/Au的Km值比HRP的Km值(Km=0.43 mmol/L)[20]低很多，該結(jié)果表明Mn3O4/Au與TMB親和力比HRP強，說明Mn3O4/Au的親和性比天然酶有更大的優(yōu)勢。

圖4 Mn3O4/Au催化不同濃度TMB(A)及H2O2(B)的動力學(xué)參數(shù)

此外，還探究了Au NPs的加入對模擬酶活性的影響。結(jié)果如表1所示，與未修飾Mn3O4相比，Mn3O4/Au復(fù)合納米酶表現(xiàn)出更好的催化活性。推測可能的原因是Au NPs的加入，可以有效提高納米酶的電子轉(zhuǎn)移效率。細胞色素c(Cyt c)作為一種可用于電子轉(zhuǎn)移過程中的反應(yīng)試劑，被用來測試Mn3O4/Au和Mn3O4納米酶的電子接受能力[21]。結(jié)果如圖5所示，當與Mn3O4/Au納米酶反應(yīng)后，Cyt c在波長520 nm和550 nm位置的特征峰顯著提高。且與Mn3O4納米酶相比，Mn3O4/Au納米酶+Cyt c反應(yīng)體系中的特征峰降低更為明顯。該研究表明Mn3O4/Au納米酶+Cyt c之間存在明顯的電子轉(zhuǎn)移?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果可知，Au NPs的加入顯著提高了Mn3O4/Au納米酶的電子轉(zhuǎn)移效率。

圖5 細胞色素c分別與Mn3O4 and Mn3O4/Au反應(yīng)之后的紫外-可見吸收光譜

表1 Mn3O4/Au納米酶的動力學(xué)參數(shù)

2.3 Mn3O4/Au復(fù)合納米酶催化TBHQ的條件優(yōu)化

2.3.1 體系pH和反應(yīng)時間的影響分別用磷酸鹽緩沖溶液、三酸緩沖溶液、檸檬酸鈉-Na2HPO4緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì)，測定Mn3O4/Au中加入TBHQ后體系的吸光度。結(jié)果表明，在檸檬酸鈉-Na2HPO4緩沖溶液介質(zhì)中，體系吸光度變化最大且穩(wěn)定。配制pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的檸檬酸鈉-Na2HPO4緩沖溶液，并測定反應(yīng)體系的吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH=7.5的檸檬酸鈉-Na2HPO4緩沖溶液介質(zhì)中，反應(yīng)體系最穩(wěn)定，TBHQ被氧化程度最好。最終選擇pH=7.5的檸檬酸鈉-Na2HPO4緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)。此外，當反應(yīng)時間為10 min時，反應(yīng)體系的吸光度即達到最大值，因此選擇10 min為最優(yōu)反應(yīng)時間。

2.3.2 Mn3O4/Au納米酶用量及溫度的影響考察了Mn3O4/Au納米酶濃度對檢測體系的影響。結(jié)果表明，當TBHQ質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，492 nm處的吸光度隨著體系中Mn3O4/Au濃度增加而增大，溶液的顏色也由無色變紅色。Mn3O4/Au體積過小或過大都影響后續(xù)TBHQ檢測的線性范圍和溶液的顏色變化。綜合考慮，選擇Mn3O4/Au體積為100 μL(母液濃度為0.2 mg/mL)進行后續(xù)實驗。此外，反應(yīng)溫度也是影響納米酶催化效率的關(guān)鍵因素之一。實驗結(jié)果表明，體系對TBHQ的催化性能隨溫度升高吸光度逐漸增大，當溫度為35 ℃時吸光度最大，因此選擇35 ℃為催化體系的反應(yīng)溫度。

2.4 方法線性范圍及檢出限

在最優(yōu)的實驗條件下，通過改變Mn3O4/Au反應(yīng)體系中TBHQ的濃度，分析方法的線性范圍。隨著TBHQ濃度的增大，溶液顏色逐漸加深，反應(yīng)體系的吸光度值也逐漸增大，當TBHQ在5～200 mg/kg范圍內(nèi)時，與吸光度值(A)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為：y=0.179x+0.177，相關(guān)系數(shù)R2=0.9940，檢出限(3σ/k)為0.6 mg/kg，定量限(10σ/k)為2 mg/kg。

2.5 干擾試驗

系統(tǒng)地考察了共存物質(zhì)和其它類似結(jié)構(gòu)合成酚類抗氧化劑對本方法的干擾，主要包括沒食子酸丙酯(PG)、2,4,5-三羥基苯丁酮(THBP)、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)、叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)、沒食子酸辛酯(OG)、2,6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT)、沒食子酸十二酯(DG)，以及葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和抗壞血酸對TBHQ的影響結(jié)果。此外，還考察了共存離子對TBHQ檢測的影響。如圖6所示，可見該納米酶檢測方法對TBHQ具有很好的選擇性。

圖6 其它類似結(jié)構(gòu)合成酚類抗氧化劑(A)、糖類(B)及離子(C)和TBHQ共存時對檢測體系的影響

2.6 實際樣品分析

我國國家標準中限定食品等中TBHQ加入量不得超過0.2 g/kg[5]，其TBHQ的定量限為20 mg/kg[22]。本方法定量限為2 mg/kg，完全滿足對TBHQ的檢測需求。為了驗證該方法的適用性，分別選用了4種不同的香精樣品，并采用加標的方式考察回收率。每個樣品平行測定6次，結(jié)果如表2所示。樣品的加標回收率在93.6%～102.2%之間，相對標準偏差(RSD)≤5.2%。

表2 香料中TBHQ的測定結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

制備了一種新型的具有納米酶活性的Mn3O4/Au復(fù)合納米酶材料，該納米酶可選擇性的用于催化氧化TBHQ生成紅色醌類化合物TQ，基于此建立了可用于高選擇性檢測香精香料中TBHQ的分析方法。并研究了Au NPs加入對納米酶活性的影響，結(jié)果表明Au NPs的加入可有效增強電子轉(zhuǎn)移效率，提升納米酶對TBHQ的催化效果。方法的檢測限可達到0.6 mg/kg，完全滿足實際的檢測需求。