郭 燕， 肖 勃， 陳 絮， 陸周霞， 萬洪志， 肖 雁， 肖 竦*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，貴州貴陽 550025：2.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550001)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)是嬰幼兒中最常見的顱外實(shí)體瘤，占兒童腫瘤的8%～10%[1,2]。研究表明，低、中風(fēng)險(xiǎn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的患兒預(yù)后非常好，但高風(fēng)險(xiǎn)患者的預(yù)后較差，患者通過化療、放療、手術(shù)、骨髓清除和免疫療法可進(jìn)行治療，但生存率仍然低于50%[3 - 5]。因此，開發(fā)微創(chuàng)、低毒、存活率高的新治療策略迫在眉睫。

光動(dòng)力療法(Photodynamic Therapy，PDT)作為一種新興的抗腫瘤治療手段，具有無創(chuàng)、毒性低、預(yù)后好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。光動(dòng)力腫瘤治療包含三種重要因素：光敏劑(Photosensitizer，PS)、光和氧。光敏劑被特定波長的光激發(fā)，光能轉(zhuǎn)移與氧結(jié)合，產(chǎn)生具有毒性的自由基和活性氧(Reactive Oxygen Species ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者壞死[6 - 8]。理想光敏劑的特點(diǎn)是：易溶于水，性質(zhì)穩(wěn)定；生物相容性高，能夠與細(xì)胞內(nèi)對氧化損傷高度敏感的部位結(jié)合；具有靶向性；光照下活性氧的量子產(chǎn)率高；可快速從體內(nèi)排出；毒副作用低[9]。

卟啉化合物是一類生物體內(nèi)的天然產(chǎn)物，血卟啉衍生物是現(xiàn)代光敏劑的起源，其對腫瘤細(xì)胞具有選擇性[10]，在光動(dòng)力治療的應(yīng)用中一直占據(jù)很重要的位置。腫瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)部和細(xì)胞核帶負(fù)電荷[11]，易與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合?；诖?，本文合成水溶性較好，表面帶正電荷的卟啉衍生物溴化5，10，15，20-四(4-吡啶基，N-丙基胺)(TPPPA)，其光動(dòng)力作用于SH-SY5Y細(xì)胞的殺傷效果明顯。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器與試劑

Epoch2超微量微孔分光光度計(jì)(美國，Biotek)；FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本，奧林巴斯公司)；FACSCelesta流式細(xì)胞儀(美國，BD)；UV-2600紫外-可見光分光光度計(jì)(日本，島津公司)；Caryeclipse熒光光譜儀(美國,VRIAN)。420 nm激光器(長春鐳仕光電科技光電有限公司)。

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y購于ATCC。2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)試劑盒購于日本Sigma公司；3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶公司；細(xì)胞培養(yǎng)材料購于北京NEST公司；凋亡試劑盒購于美國BD公司；單線態(tài)氧綠色熒光探針(SOSG)購于美國Invitrogen公司；三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)購于山東金昊化工公司；丙酮購于天津科密歐公司；乙腈購于山東紫翔化工公司。

1.2 TPPPA合成和表征

TPPPA的合成線路如下：

稱取5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉(H2TPyP)123 mg(0.2 mmol)和N-Boc-3-氨基丙基溴952 mg(4 mmoL)，加入20 mL超干DMF，氮?dú)獗Ｗo(hù)下120 ℃反應(yīng)24 h。冷卻至室溫，將反應(yīng)液緩慢滴入50 mL乙腈中，待沉淀完全后，減壓抽濾，分別用三氯甲烷、丙酮洗滌沉淀。將沉淀溶于10 mL三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷混合溶液(體積比1∶1)，常溫反應(yīng)12 h。蒸去溶劑，加水溶解，調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，蒸去溶劑，再用5 mL水/乙腈混合溶液(體積比1∶1)重結(jié)晶，得到紫紅色固體。固體產(chǎn)物53 mg，產(chǎn)率約為22%。

1H NMR(DMSO,400 MHz):δ:9.61(d,8H),9.27(s,8H),9.03(d,8H),5.01(t,8H),3.47(t,8H),2.56(m,8H)。

將制備的TPPPA配制成濃度為10 μmol/L的溶液，測定動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)，紫外-可見吸收光譜和熒光光譜。加入2.5 μL的SOSG溶液混勻，420 nm激光照射檢測單線態(tài)氧。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

6孔板培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，加入1 mL濃度為10 μmol/L的TPPPA溶液共同孵育24 h，420 nm激光照射后，用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測

6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，用濃度為10 μmol/L的TPPPA溶液孵育24 h，然后加入1 mL濃度為10 μmol/L DCFH-DA孵育20 min，420 nm激光照射細(xì)胞后，繼續(xù)孵育30 min，用無血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，對照組不加光敏劑。用倒置熒光顯微鏡采集熒光圖像，用圖像軟件ImageJ進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞存活率檢測

96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，加入100 μL一定濃度的TPPPA溶液共同孵育24 h，對照組不加藥物孵育，光照后繼續(xù)孵育24 h，每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min，用超微量微孔分光光度計(jì)，于490 nm波長處測量吸光度。計(jì)算細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、激光照射組、TPPPA藥物組和TPPPA-PDT組。6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，加入1 mL濃度為10 μmol/L的TPPPA溶液孵育24 h，420 nm激光照射(50 mW/cm2,3 min)，繼續(xù)避光孵育6 h，用凋亡試劑盒檢測，流式細(xì)胞儀分析。

1.7 TPPPA在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的分布

采用激光共聚焦專用培養(yǎng)皿(Φ15 mm玻璃皿)培養(yǎng)細(xì)胞，加入1 mL濃度為10 μmol/L的TPPPA溶液孵育24 h后，再加入DAPI溶液孵育30 min，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞5次，420 nm激光照射(50 mW/cm2，1 min)后，用激光共聚焦掃描顯微鏡采集熒光圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)檢測

藥物具備良好的水溶性有利于其在體液內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)合到作用部位，從而產(chǎn)生藥物效應(yīng)。一般來說，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的孔隙直徑約60～120 nm，親水性藥物的分散粒徑大小，影響藥物通過細(xì)胞膜的水性通道，進(jìn)而影響藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。當(dāng)H2TPyP接入丙基胺后，吡啶基的側(cè)鏈增長，空間位阻增大，分子間的靜電斥力使之在水中的溶解性得到改善。DLS結(jié)果如圖1所示，25 ℃下，TPPPA和H2TPyP的溶液均表現(xiàn)為單峰分布，大小均一，水合動(dòng)力學(xué)粒徑分別為～50 nm，～120 nm。TPPPA分散粒徑減小，更易于通過細(xì)胞膜，促使藥物有效進(jìn)入細(xì)胞。

圖1 H2TPyP和TPPPA的動(dòng)態(tài)光散射圖

10 μmol/L TPPPA水溶液與H2TPyP的DMSO溶液的紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜比較，其強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(圖2)，體現(xiàn)良好的光譜性質(zhì)。TPPPA的紫外-可見吸收光譜包括兩個(gè)特征吸收(圖2A)：420 nm左右的Soret帶,以及500～600 nm區(qū)間的弱吸收Q帶。向長波方向各吸收峰相對強(qiáng)度逐漸減弱。424.5 nm出現(xiàn)最大吸收(2.36)。如圖2B所示，425 nm波長激發(fā)下，在710 nm發(fā)射較強(qiáng)的明亮紅色熒光，接近近紅外區(qū)域，近紅外光在組織或細(xì)胞中的穿透力有明顯優(yōu)勢，利于在細(xì)胞及組織中進(jìn)行觀察。

圖2 H2TPyP、TPPPA的紫外-可見吸收光譜圖(A)和熒光光譜圖(B)

2.2 單線態(tài)氧的生成

卟琳類光敏劑主要的毒性產(chǎn)物是單線態(tài)氧，光照條件下由于激發(fā)光、光敏劑和分子氧的相互作用，平衡被打破，光敏劑受激光照射后與分子氧結(jié)合生成單線態(tài)氧的能力，直接影響光動(dòng)力療法的效果。利用熒光探針SOSG 檢測產(chǎn)生單線態(tài)氧的量，如圖3。TPPPA在420 nm、30 mW/cm2光照激發(fā)下，產(chǎn)生的單線態(tài)氧產(chǎn)率隨光照時(shí)間增加而上升，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。由于丙胺基的引入，整個(gè)化合物的電子云密度降低，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)的能量降低，使躍遷更易發(fā)生，處于激發(fā)態(tài)的光敏劑發(fā)生能量轉(zhuǎn)移易產(chǎn)生較多的單線態(tài)氧，如果作用于腫瘤細(xì)胞，會(huì)引起一系列生理變化和對腫瘤細(xì)胞的毒性殺傷。這一結(jié)果為藥物TPPPA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后的殺傷作用提供了基礎(chǔ)。

圖3 TPPPA的單線態(tài)氧檢測

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

在倒置熒光顯微鏡白場下觀察光動(dòng)力作用下細(xì)胞的形態(tài)變化(圖4)。對照組細(xì)胞呈梭形或多角形貼壁生長，有神經(jīng)突樣突起(圖4A)。實(shí)驗(yàn)組光照1 min后出現(xiàn)細(xì)胞變圓，胞漿中充滿顆粒，胞膜邊緣不光滑(圖4B)。光照2 min 后大部分細(xì)胞變圓，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡(圖4C)。光照3 min后可觀察到細(xì)胞膜崩解(圖4D)。由于丙胺基的引入使TPPPA帶正電荷，增強(qiáng)了與腫瘤細(xì)胞的陰離子基團(tuán)的相互作用，親和性增加，光動(dòng)力作用下細(xì)胞形態(tài)變化明顯。

圖4 倒置顯微鏡下SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)改變(200×)

2.4 SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測

腫瘤細(xì)胞對ROS非常敏感，ROS的存在是光動(dòng)力作用殺傷腫瘤細(xì)胞的重要決定因素[13,14]，采用DCFH-DA熒光探針對其進(jìn)行檢測[15]。TPPPA與細(xì)胞孵育24 h，420 nm激光(功率為50 mW/cm2)照射，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS明顯增加(圖5)。對圖5A進(jìn)行熒光定量分析，如圖5B所示，顯示出光照3 min細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS約為光照1 min時(shí)的兩倍(P<0.01)。

圖5 TPPPA作用于SH-SY5Y細(xì)胞后ROS的產(chǎn)生

2.5 光動(dòng)力作用檢測

MTT結(jié)果顯示，TPPPA的暗毒性很低(圖6A),420 nm激光的光毒性很小(圖6B)，TPPPA濃度為10 μmol/L，光照強(qiáng)度、光照時(shí)間均與細(xì)胞存活率成負(fù)相關(guān)(圖6C和6D)，光照(50 mW/cm2)3 min時(shí)的光動(dòng)力作用最強(qiáng)，細(xì)胞存活率僅為17.33%。采用最優(yōu)檢測條件(50 mW/cm2，3 min)，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，腫瘤細(xì)胞SH-SY5Y的凋亡率達(dá)到46.32%(圖7)。細(xì)胞凋亡的方式有很多種，其中ROS的增加會(huì)引發(fā)抗氧化能力增強(qiáng)，細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷[16]。線粒體是產(chǎn)生ROS的主要部位，大量的ROS引起線粒體相關(guān)的促凋亡蛋白釋放，引起細(xì)胞凋亡[17]。

圖6 SH-SY5Y細(xì)胞存活率

圖7 流式細(xì)胞儀檢測SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡情況(50 mW/cm2，3 min)

2.6 TPPPA在SH-SY5Y細(xì)胞中的分布

4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)在熒光顯微鏡下發(fā)出藍(lán)色熒光，可以和DNA結(jié)合用于活細(xì)胞細(xì)胞核的染色[18]。TPPPA發(fā)出的紅色熒光可以指示其在細(xì)胞中滯留的位置。激光照射細(xì)胞(50 mW/cm2，1 min)孵育10 min后，可觀察到TPPPA廣泛分散在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖8A)，孵育30 min后，TPPPA主要集中于細(xì)胞核(圖8B)。由于TPPPA被丙胺基官能團(tuán)修飾后帶正電荷，且細(xì)胞線粒體內(nèi)部和細(xì)胞核DNA表面均存在負(fù)電荷，光動(dòng)力作用過程中，光敏劑通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，隨著時(shí)間推移，再向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。這可能因?yàn)門PPPA在光動(dòng)力作用過程中線粒體功能逐漸發(fā)生障礙，結(jié)合作用減弱,通過靜電作用定位于細(xì)胞核[19]。

圖8 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察TPPPA在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的分布(標(biāo)尺=10 μm)

3 結(jié)論

合成獲得的卟啉衍生物TPPPA，由于引入了極性丙基胺基團(tuán)，水溶性較好，光學(xué)性能優(yōu)良。借助卟啉衍生物TPPPA發(fā)出的紅色熒光可觀察藥物在細(xì)胞中的分布情況。TPPPA水溶液帶正電荷，激光照射后與細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)，隨后集中于細(xì)胞核。此過程產(chǎn)生的ROS，有效殺傷SH-SY5Y細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TPPPA具備理想光敏劑的特征，這將為設(shè)計(jì)和篩選帶正電荷的光敏劑提供依據(jù)。