樊輕亞， 王萬好

(1.信陽職業(yè)技術學院藥學院，河南信陽 464000;2.河南同源制藥有限公司，河南信陽 464000)

還亮草(DelphiniumanthriscifoliumHance)屬毛茛科、翠雀屬多年生草本植物,分布于我國廣東、廣西、貴州、浙江、江西、河南等省，用于治療風濕痛、半身不遂、癰瘡癬癩等疾病。藥用還亮草中的主要有效成分是生物堿類物質，發(fā)揮重要的藥理作用[1]。因此，研究還亮草中生物堿成分具有較高的臨床應用價值。

濁點萃取(Cloud Point Extraction，CPE)是一種新型分離技術，該技術主要利用表面活性劑溶液的增溶和分相實現(xiàn)溶質的分離和富集。濁點萃取不使用揮發(fā)性有機溶劑，無毒，操作方便，同時具有很高的富集效率，在中藥材有效成分的萃取分離中具有良好的應用前景[2 - 12]。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)聯(lián)用技術具有精密度高、準確度好、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在中藥的定性定量分析中具有廣泛的應用[13 - 17]。本文采用濁點萃取方法分離富集還亮草中的生物堿成分，并與UPLC-MS/MS聯(lián)用測定該藥材中5種生物堿的含量，為還亮草的開發(fā)和應用提供可靠的依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

美國 Waters Xevo TQ-MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧離子源。DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)。

洋翠雀堿、高硬飛燕草堿、硬飛燕次堿、硬飛燕草堿、巴比翠雀堿標準品(純度>98%，成都普菲德生物技術有限公司)。精密稱取洋翠雀堿、高硬飛燕草堿、硬飛燕次堿、硬飛燕草堿、巴比翠雀堿5種對照品各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，得各對照品儲備溶液。分別吸取儲備溶液各1 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容后即得混合對照品溶液。甲醇、乙腈(色譜純，德國默克)。實驗用水為超純水。

還亮草藥材均購于網(wǎng)絡藥材市場，經(jīng)鑒定為還亮草(DelphiniumanthriscifoliumHance)全草。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波輔助提取稱取一定量100目的還亮草藥材粉末于提取罐中，按照1∶60的料液比加入95%乙醇后，置于密閉微波瓶中，加熱提取(80 ℃，10 min)，提取液在60 ℃下?lián)]干，用甲醇定容至200 mL，備用[18]。

1.2.2 濁點萃取取一定量的Triton X-114，加入一定量的水，超聲溶解，配制成4%的Triton X-114溶液，加入0.4 g的NaCl振搖，靜置，使形成濁點體系。取“1.2.1”濃縮液于離心管中，揮干溶劑，加入配制好的Triton X-114濁點體系溶液，超聲溶解，用稀HCl調節(jié)pH值為8，55 ℃水浴平衡25 min，分層后在3 000 r/min下離心5 min。取下相置于圓底燒瓶中，揮干，用甲醇定容至10 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾后，用UPLC-MS/MS法測定。

1.2.3 溶劑法萃取取“1.2.1”濃縮液減壓抽濾，濾液旋干，用30 mL HCl(pH=2)超聲溶解，傾出，置于分液漏斗，用氯仿萃取后的水相用1%NaOH溶液調節(jié)pH為10，再用氯仿萃取3次，每次30 mL，收集氯仿層，旋干，用甲醇溶解，定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.3 樣品分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BHE C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm；美國Waters公司)；流動相：乙腈(A)-0.1%三乙胺(B)；梯度洗脫程序:0～3 min，2%～10%A；3～8 min，10%～50%A；8～10 min，50%～70%A； 10～15 min，70%～2%A；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：3 μL。

1.3.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子(ESI+)模式；離子源溫度：130 ℃；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣(N2)流速：9.0 L/min；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：2.5 L/h。

2 結果與分析

2.1 濁點體系的篩選及萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 濁點體系的選擇本實驗分別選用Triton X-100、Triton X-114、Span-80、Tween-80、 PONPE 7.5、Genapol X-080、油酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯作為表面活性劑，加入NaCl和一定量的水超聲溶解形成濁點萃取體系溶液，水浴加熱，測定其濁點溫度。結果顯示：Tween-80、Span-80、PONPE 7.5分相較慢；Genapol X-080、油酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯表面活性劑聚集成糊狀；Triton X-100、Triton X-114分相較快，表面活性劑富集在下相。但Triton X-100濁點溫度為65 ℃，而Triton X-114濁點溫度為35 ℃，濁點溫度較低，因此選擇萃取體系中Triton X-114作為表面活性劑，NaCl作為添加劑進行萃取。

2.1.2 Triton X-114濃度和 NaCl添加量對萃取率的影響本實驗考察了不同濃度的表面活性劑和不同NaCl的添加量對還亮草中生物堿萃取率的影響。從圖1(a)中可以看出生物堿的提取率隨Triton X-114濃度的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢。這是因為表面活性劑濃度過低時，萃取分層時表面活性劑富集相過少，無法進行相分離，隨著濃度的增大，形成的膠束越來越多，增溶作用越強，越有利于生物堿的提取。但在Triton X-114濃度高于4%之后，提取效率呈下降趨勢。因為隨著表面活性劑濃度的增大，溶液黏度增大，擴散能力減弱，膠束難滲入到基質的內(nèi)部，導致膠束內(nèi)部結構發(fā)生變化導致提取率降低。因此，Triton X-114的最佳濃度為4%。圖1(b)表明，隨著NaCl用量的增加，萃取效率一直呈上升趨勢， NaCl用量增加到0.4 g，達到了平衡。這是因為溶液中加入電解質 NaCl 可增大表面活性劑膠團的聚集數(shù)，增大溶液離子強度，使水相密度增大，加速兩相分離，降低了濁點溫度，從而提高對還亮草生物堿的增溶能力。因此選擇NaCl的加入量為0.4 g。

圖1 Triton X-114的濃度和 NaCl的用量對還亮草生物堿萃取率的影響

2.1.3 pH對萃取率的影響在濁點萃取中，待測物與非離子表面活性劑膠束以疏水分配為主要方式，樣品溶液pH值影響兩相分配的效果，通常情況下會將其酸度值調至物質呈電中性狀態(tài)，易于與膠束結合。本實驗中的5種生物堿均顯弱堿性，加稀HCl或稀氨水調節(jié)pH值至5～10。由圖2可知pH為8時，萃取率最大。這是因為在酸性環(huán)境下，弱堿性物質易電離成離子狀態(tài)，不易與表面活性劑結合，難以被膠束萃取，故萃取率較低。而當萃取物pH過高時，使表面活性劑富集相由下相轉移至溶液上層，不便于兩相分離。因此選擇HCl調節(jié)pH值為8比較合適。

圖2 pH值對還亮草中生物堿萃取率的影響

2.1.4 平衡溫度和平衡時間對萃取率的影響本文分別考察了在25～85 ℃水浴中平衡5～30 min對萃取率的影響。結果如圖3所示，萃取體系在水浴溫度55 ℃下平衡25 min時萃取率達到最大。這是因為當平衡溫度低于表面活性劑濁點時，兩相系統(tǒng)無法形成；平衡溫度上升，在水溶液中，以水合形式存在的表面活性劑會使膠束中氫鍵斷裂脫水，使表面活性劑富集相體積減小，表面活性劑更易沉降，引發(fā)更好的相分離，所以平衡溫度要稍高于濁點溫度約15～25 ℃，當溫度過高時，容易引起藥物氧化分解，故萃取率下降[19]。延長平衡時間有利于目標物在濁點體系中的分配，當平衡時間為25 min時，萃取率基本達到平穩(wěn)的狀態(tài)，若過長的平衡時間反而會增加樣品的處理時間，同時會影響實驗周期。

圖3 平衡溫度和平衡時間對還亮草生物堿萃取率的影響

通過單因素試驗優(yōu)化得到了濁點萃取還亮草中5種生物堿的最優(yōu)條件：4%的Trion X-114，NaCl的添加量為0.4 g，溶液的pH值調節(jié)為8，平衡溫度55 ℃，平衡時間25 min。

2.2 色譜-質譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化對還亮草濁點萃取后的提取液進行UPLC-MS/MS分析，考察了有機相溶劑(乙腈、甲醇)與水，以及不同種類的緩沖溶液作為流動相時的分離效果和對離子化程度的影響。結果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動相時，分離度更好，且能明顯縮短分析時間，而在流動相中加入一定比例的三乙胺可以改善峰形，減少色譜峰拖尾。因此，本實驗以乙腈-0.1%三乙胺溶液為流動相，選擇梯度洗脫方式，5種生物堿成分可以得到良好分離，且各色譜峰的峰形好、柱效高。所得總離子流色譜圖如圖4所示。

圖4 藥用還亮草濁點萃取后提取液的總離子流(TIC)色譜圖

2.2.2 質譜條件的優(yōu)化和裂解一級質譜在全掃描模式下，同時采集正、負離子信號，結果發(fā)現(xiàn)ESI-模式下幾乎無質譜響應，因此選擇 ESI+模式，分別找出5種化合物的[M+H]+準分子離子峰。并對干燥氣體、霧化器壓力、干燥氣流量等參數(shù)進行優(yōu)化，然后對母離子進行碰撞誘導解離，選取所得豐度較高的兩個子離子作為特征離子，選擇響應最高的子離子作為定量離子。5種化合物的質譜參數(shù)見表1。

表1 5種生物堿的質譜參數(shù)

在ESI+-MS/MS條件下，5種化合物主要發(fā)生側鏈斷裂，根據(jù)二質譜級數(shù)據(jù)，可以推測5種化合物均發(fā)生A和B兩種裂解路徑。5種化合物的 A裂解方式都相同，即16位脫甲氧基；B裂解途徑中硬飛燕次堿和硬飛燕草堿發(fā)生1位羥基的斷裂，高硬飛燕草堿和洋翠雀堿發(fā)生4位酯基的斷裂，巴比翠雀堿發(fā)生6位的脫羧反應。5種化合物質譜裂解途徑見圖5。

圖5 5種生物堿的質譜裂解途徑

2.3 線性范圍、檢出限與加標回收率

取5種生物堿標準溶液，分別配制成一系列濃度的混合標準溶液，按優(yōu)化濁點萃取及UPLC-MS/MS法分析測定。以目標定量離子的峰面積(Y)為縱坐標，以質量濃度(X，mg/L)為橫坐標繪制標準曲線。取已知含量的還亮草樣品 3 份，分別添加 0.1 mg/g、0.25 mg/g、0.50 mg/g 3個濃度水平的混合對照品溶液，采用“1.2.1”及“1.2.2”方法進行提取和萃取，在優(yōu)化色譜和質譜條件下進樣定量分析，每個水平做6個平行，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)。5種生物堿的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限(S/N=3)及加標回收率結果見表2。

表2 5種生物堿的標準工作曲線、線性范圍、檢出限及加標回收率

2.4 穩(wěn)定性與重復性實驗

取供試樣品和混合對照品溶液，于室溫下放置0～24 h后，分別于0、4、8、10、12、24 h進樣進行測定。結果表明供試樣品和對照品溶液在24 h穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定性和重復性的RSD小于2.5%。

2.5 萃取方法的比較及應用

精密稱取3個產(chǎn)地還亮草藥材各100 g，按照“1.2.1”方法提取后，分別按照“1.2.3”濁點萃取法(CPE)和“1.2.4”溶劑法(SE)萃取，然后按“1.3”方法測定其含量，結果見表3。由表3可知，3個產(chǎn)地的還亮草生物堿含量分布不同，3個產(chǎn)地中硬飛燕草堿含量最高，廣西產(chǎn)地的5種生物堿含量明顯高于其它兩地，可能和該植物生長時所需的溫度與地質條件有關。3批還亮草中采用濁點萃取法的萃取率是傳統(tǒng)溶劑萃取法的2倍左右，可能由于傳統(tǒng)溶劑萃取法操作復雜，提取后需經(jīng)過多次萃取，在進行氯仿萃取時每次都需要蒸發(fā)溶劑，導致待測物在蒸發(fā)及多次的轉移過程中損失較多；而濁點萃取法集分離富集與一體，操作簡便，和傳統(tǒng)溶劑法相比不需要蒸發(fā)溶劑，避免了待測物的損失，所以萃取率比傳統(tǒng)溶劑法高。且濁點萃取法中所用表面活性劑無毒無害，用量小，降低了污染，且能夠保護被萃取物質的原有特性，能夠提供較高的萃取率，是一種環(huán)境友好型的萃取富集方法，符合綠色化學發(fā)展的要求。

表3 3個批次還亮草藥材5種生物堿的提取分析結果(n=3)

3 結論

本文將濁點萃取技術應用于還亮草中生物堿的萃取，并優(yōu)化了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定生物堿的條件。該萃取方法簡單快速，萃取效率高，是一種高效的、具有極大發(fā)展前景的萃取技術；超高效液相-串聯(lián)質譜法靈敏度高，分離度好，可以縮短分析時間，滿足還亮草藥材中5種生物堿成分的同時檢測要求，可為還亮草制劑的開發(fā)及質量控制提供了可靠依據(jù)。