陳嵐卿，王宇寧，李典一，徐路遙，李廉杰，李澤浩，劉華，劉茜

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院法醫(yī)學系，湖北 武漢 430030；2.法庭毒物分析公安部重點實驗室 北京市公安局，北京 100000

受磷蛋白（phospholamban，PLN）是一種以單體或五聚體形式存在于肌漿網(wǎng)上的磷酸化蛋白，其絲氨酸16（serine 16，Ser16）和蘇氨酸17（threonine 17，Thr17）位點可分別通過cAMP 依賴性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和鈣離子-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）被磷酸化。肌漿網(wǎng)和內質網(wǎng)Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic and endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）屬于多基因家族，SERCA2a 在心肌細胞中含量最豐富，負責在心肌舒張期將大多數(shù)Ca2+從胞質中回攝至肌漿網(wǎng)，對調節(jié)胞質Ca2+濃度起主要作用[1-2]。PLN 通過與SERCA2a 的相互作用，在心肌Ca2+調節(jié)中發(fā)揮重要作用。

烏頭堿是一類主要來自烏頭屬植物的藥物，在傳統(tǒng)中藥以及民間飲食中應用廣泛[3-4]。本研究采用新型四環(huán)素調控表達系統(tǒng)（商品名T-RExTM系統(tǒng)）和Flp/FRT 位點特異性重組技術，將人受磷蛋白基因穩(wěn)定整合進人源性細胞的基因組FRT 位點（重組酶識別位點）處，利用多西環(huán)素（doxycycline，Dox）誘導，解除TRExTM細胞中四環(huán)素抑制子TetR 對啟動子中TetO2的抑制，完成細胞中目的蛋白的表達[5-6]，并利用特異抗生素抗性篩選出穩(wěn)定表達目的基因的細胞，從而構建人源性PLN 穩(wěn)定表達Flp-InTMT-RExTM293 細胞系（human phospholamban stably expressing Flp-InTMT-RExTM293 cell line，hPLN-293），并初步探索其用于烏頭堿心臟毒性分子機制研究的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒及主要試劑

Flp-InTMT-RExTM293細胞系、pcDNATM5/FRT/TO（以下簡稱pDFT）載體試劑盒、pOG44 Flp-重組酶表達載體（美國Invitrogen 公司），DH5α 感受態(tài)細胞（美國Thermo Scientific 公司），MGC Human PLN Sequence-Verified cDNA（英國Horizon 公司），聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）轉染劑（美國Sigma-Aldrich 公司），Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清、滅瘟素、潮霉素B、Dox（美國Gibco 公司），抗PLN 單克隆抗體、抗Thr17-P-PLN 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司），抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白單克隆抗體（美國Proteintech 公司），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠IgG、HRP 標記的羊抗兔IgG、異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的羊抗鼠IgG（中國Biosharp 公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色試劑、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、放射免疫沉淀法裂解緩沖液（radio-immunoprecipitation assay buffer，RIPA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、磷酸化蛋白酶抑制劑、脫脂奶粉、多聚甲醛固定液（中國Servicebio 公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；德國BioFroxx 公司）。

1.2 重組表達質粒的構建

采用FastCloning 方法[7]將目的基因PLN 的開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列插入pDFT 載體的多克隆位點形成重組質粒pDFT-PLN-Flag。根據(jù)載體序列設計合適引物，對重組質粒進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物電泳驗證，并對含有目標DNA 大小片段的重組質粒進行測序。序列正確的質粒轉化DH5α 感受態(tài)細胞復制培養(yǎng)、提取備用。

1.3 293 細胞轉染及篩選

用DMEM 在直徑10cm 細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)Flp-InTMT-RExTM293 細胞系細胞，待細胞鋪滿皿底50%～70%時，以PEI 轉染劑將構建的pDFT-PLN-Flag 與pOG44 Flp-重組酶表達載體共轉染Flp-InTMT-RExTM293 細胞。轉染細胞放入37 ℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng)4～6 h 后換液，換液后再培養(yǎng)1 d 后用無抗生素的DMEM 按1∶2傳代細胞，再培養(yǎng)1 d后換含有15 μg/mL滅瘟素和150 μg/mL 潮霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，持續(xù)篩選培養(yǎng)出含滅瘟素和潮霉素雙重抗性的穩(wěn)定細胞株。從篩選的穩(wěn)定細胞株中提取基因組DNA 進行測序。以美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中的人源性受磷蛋白基因ORF 序列為參考序列，驗證插入序列的正確性。經(jīng)驗證后的穩(wěn)定細胞株命名為hPLN-293細胞。

1.4 利用間接免疫熒光法檢測hPLN-293 細胞中PLN 的表達

陰性對照組：向按1.3 節(jié)步驟初步篩選出的受磷蛋白過表達重組單克隆穩(wěn)定細胞株（hPLN-293 細胞）中，加入Dox，使Dox 在總體系中的終質量濃度為200 ng/mL，用4%多聚甲醛固定后用PBS 緩沖液代替一抗進行孵育，再用FITC 標記的羊抗鼠IgG 二抗孵育，利用DAPI 染色試劑對其進行復染，進行抗體特異性檢驗。

未加Dox 誘導組：取hPLN-293 細胞，不加入Dox。用4%多聚甲醛固定后，用鼠來源的抗人PLN單克隆抗體孵育，再用FITC 標記的羊抗鼠IgG 二抗孵育，利用DAPI 染色試劑對其進行復染。

加入Dox 誘導組：取hPLN-293 細胞，加入Dox，使Dox 在總體系中的終質量濃度為200 ng/mL。用4%多聚甲醛固定，用鼠來源的抗人PLN 單克隆抗體孵育，再用FITC 標記的羊抗鼠IgG 二抗孵育，利用DAPI染色試劑對其進行復染。

三組細胞在蔡司LSM 800 with Airyscan 激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS 公司）下觀察PLN 的表達。

1.5 利用Western 印跡法檢測hPLN-293 細胞中PLN 的表達

將hPLN-293 細胞持續(xù)培養(yǎng)、傳代，選1 代、5 代、10 代細胞，分別在培養(yǎng)基中加入Dox（200 ng/mL），誘導hPLN-293 細胞PLN 的表達。誘導培養(yǎng)48 h 后，用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細胞，提取總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳，轉膜后，5%脫脂奶室溫封閉膜2 h。以鼠來源的抗PLN 單克隆抗體作為一抗，HRP 標記的羊抗鼠IgG 作為二抗，利用蛋白免疫印跡法檢測hPLN-293 細胞中PLN 的表達情況。以GAPDH 為內參，用未加Dox 誘導的相同細胞作為對照，計算PLN 相對表達量。用GraphPad Prism 5.0（美國GraphPad Software 公司）對第5、10 代各代內細胞的PLN 相對表達量進行t檢驗，分析細胞中PLN 表達情況并判斷Dox 對于細胞中PLN 表達的影響，雙側檢驗水準α=0.05。

1.6 hPLN-293 細胞烏頭堿染毒對Thr17-P-PLN 表達量的影響

將構建成功的hPLN-293 細胞分為染毒組和無毒組。染毒組：烏頭堿終濃度為1 μmol/L、染毒時間為2 h。無毒組：不進行染毒處理。兩組細胞按1.5 節(jié)步驟進行Western 印跡法檢測。兩組細胞中磷酸化蛋白的檢驗均改用含蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解細胞，并改用BSA 封閉液封閉膜2 h。以兔來源的抗Thr17-P-PLN 單克隆抗體作為一抗，HRP 標記的羊抗兔IgG 作為二抗，以GAPDH 為內參，計算Thr17-P-PLN 相對表達量。以鼠來源的抗PLN單克隆抗體作為一抗，HRP 標記的羊抗鼠IgG 作為二抗，以GAPDH 為內參，計算PLN 相對表達量。以Thr17-P-PLN 與PLN 總蛋白表達量的比值（Thr17-PPLN/PLN）作為PLN Thr17 位點磷酸化的參考指標，用GraphPad Prism 5.0（美 國GraphPad Software 公司）對無毒組和染毒組進行配對t檢驗，觀察烏頭堿對于PLN Thr17 位點磷酸化的影響。雙側檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 hPLN-293 細胞的基因測序驗證結果

從轉染成功的細胞中提取基因組進行測序，測序結果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中人源性PLN 基因ORF 序列一致（圖1）。

圖1 轉染成功的細胞中基因測序結果Fig.1 Gene sequencing results in successfully transfected cells

2.2 間接免疫熒光法檢測hPLN-293 細胞中PLN 的表達

利用間接免疫熒光法對hPLN-293 細胞中PLN表達情況的檢測結果（圖2）顯示：抗體非特異性結合（綠色熒光信號）少，說明抗體具有較好的特異性。未加Dox 誘導組顯示較弱的綠色熒光信號；加入Dox 誘導組綠色熒光信號顯示清晰穩(wěn)定，說明hPLN-293 細胞系構建成功。

圖2 間接免疫熒光法檢測hPLN-293 細胞中PLN 表達Fig.2 Indirect immunofluorescence detection of PLN expression in hPLN-293 cells

2.3 hPLN-293 細胞中PLN 的表達情況

利用t檢驗對第1、5、10 代細胞PLN 的表達情況進行分析，結果（圖3、表1）顯示：第5、10 代加入Dox誘導組的PLN 表達相對于未加Dox 誘導組明顯增高（P＜0.05）。

表1 Dox 誘導對hPLN-293 細胞中PLN 相對表達量的影響Tab.1 Effects of Dox induction on the relative expression of PLN in hPLN-293 cells（xˉ±s）

圖3 Western 印跡法檢測hPLN-293 細胞中PLN的表達量Fig.3 PLN expression in hPLN-293 cells detected by Western blot

2.4 烏頭堿染毒對hPLN-293 細胞中Thr17-P-PLN表達的影響

無毒組Thr17-P-PLN/PLN 為1，染毒組的Thr17-P-PLN/PLN 為0.88±0.07（n=6），應用配對t檢驗進行比較，結果（圖4）顯示，無毒組和染毒組PLN 的Thr17位點磷酸化水平之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），烏頭堿染毒后hPLN-293 細胞中PLN Thr17 位點磷酸化水平降低。

圖4 Western 印跡法檢測烏頭堿染毒對hPLN-293 細胞中PLN Thr17 位點磷酸化水平的影響Fig.4 Effects of aconitine exposure on the phosphorylation level of Thr17 site of PLN in hPLN-293 cells detected by Western blot

3 討論

本研究采用Flp/FRT 位點特異性重組技術實現(xiàn)目的基因在細胞基因組轉錄活性區(qū)穩(wěn)定持續(xù)的表達，建立的穩(wěn)定表達細胞系有2 個優(yōu)點：（1）由于在載體pDFT 中作為篩選標記的潮霉素B 抗性基因上游沒有起始密碼子ATG，只有需要插入的基因轉錄成功完成特異性整合后，潮霉素B 抗性基因才能在整合位點上游的起始密碼子和啟動子的調控下進行表達，細胞才會具有潮霉素B 抗性，而當重組質粒隨機整合進基因組非FRT 位點時，篩選過程中細胞將會死亡[8-9]，通過抗生素篩選，存活的細胞都是陽性克隆。（2）所用pcDNA5/FRT/TO 載體的CMV 啟動子中含有四環(huán)素操縱子序列TetO2，pDFT 載體含有FRT 位點，與pOG44載體共轉染，并利用重組酶進行定向重組[9]。所選用的Flp-InTMT-RExTM293 細胞系含有四環(huán)素抑制子TetR，與啟動子中的TetO2序列結合，抑制目的基因的轉錄[5]。轉染篩選后的細胞經(jīng)Dox 誘導，解除TetR 對TetO2的抑制，從而表達所需的目的蛋白。

本研究通過細胞形態(tài)、觀察驗證實驗等方法證實，構建的hPLN-293 細胞系能夠穩(wěn)定表達PLN，并具有良好的表達豐度，說明導入的目的基因已經(jīng)整合入載體細胞中，隨著hPLN-293 細胞株的傳代能夠穩(wěn)定表達就可以很好地應用于后續(xù)的實驗。

PLN/SERCA2a 調控體系的失衡在心力衰竭[10]、急性心肌梗死[11]、擴張性心肌病[1]等心臟疾病的進展中起到重要作用。SERCA2a 表達減少和活性下降是心力衰竭的一個重要特征，因此，通過轉基因等方法上調SERCA2a 表達或提高其活性成為治療心力衰竭的一項策略[9]。有研究[10]證明，心肌缺血所造成的酸中毒和ATP 代謝障礙會抑制PLN 的活性，導致SERCA動力學受損，降低肌漿網(wǎng)的鈣負荷，從而產(chǎn)生急性心肌梗死后致死性室性心律失常。hPLN-293 細胞系的構建可以促進PLN 表達干預、SERCA2a 與PLN 比值調節(jié)等研究的進展，有助于心臟疾病治療潛在方法的探究。

PLN/SERCA2a 這一調控體系以及其上游調控蛋白CAMK2、PKA 在心臟相關的藥理機制研究以及毒物相關的毒理研究中發(fā)揮著重要作用。有研究[12]報道，我國傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分黃芪皂苷Ⅳ可能通過PKA 途徑增強PKA-Cα 基因及Ser16-PLN 表達，減輕缺氧/復氧所致培養(yǎng)心肌細胞SERCA2a 活性降低，從而減輕心肌細胞損傷。有研究[13]證實，銀杏提取物EGb761 可通過影響PKA 信號通路，上調PLN磷酸化水平，解除PLN 對鈣調節(jié)蛋白SERCA2a 活性的抑制，減輕細胞內鈣超載的程度，改善心肌的舒張功能，從而延緩心肌細胞的老化。而常見的三氧化二砷、蒽環(huán)類藥物都被指出其心臟毒理作用可能與心肌細胞的鈣超載有關[14-15]。

此人源性PLN 穩(wěn)定表達細胞系的構建，將為PLN表達及其磷酸化水平調節(jié)機制的研究提供有效的實驗工具。利用hPLN-293 進行了烏頭堿染毒的初步研究，發(fā)現(xiàn)烏頭堿可以降低Thr17-P-PLN 磷酸化水平，提示PLN 磷酸化可能是烏頭堿影響PLN/SERCA2a 調控體系、對心肌細胞的鈣平衡產(chǎn)生影響的機制之一。同時，該細胞系的建立，也將有助于其他毒（藥）物對PLN 及其磷酸化影響機制的研究。