孫烈婷，王文婷，陳曼，王芳，劉瑩

1.甘肅迪安同享醫(yī)學(xué)檢驗中心司法鑒定所，甘肅 蘭州 730000；2.迪安鑒定科學(xué)研究院，浙江 杭州 310000；3.中國科學(xué)院北京基因組研究所，北京100000

1 案 例

1.1 簡要案情

因親緣關(guān)系鑒定需要，被檢父姚某、孩子母親梁某及孩子要求進行親子鑒定，采集末梢血，制成血卡，陰干后避光干燥保存。

1.2 檢驗過程與結(jié)果

1.2.1 初次檢驗

使用MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)（北京閱微基因技術(shù)有限公司）復(fù)合擴增3 人血樣基因座，反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)均按照試劑盒說明書設(shè)置。使用3130xl基因分析儀（美國Applied Biosystems 公司）電泳分離擴增產(chǎn)物，GeneMapper?ID-X軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）分析電泳結(jié)果，等位基因分型標準物（ladder，北京閱微基因技術(shù)有限公司）及血樣分型的相關(guān)數(shù)據(jù)見圖1。

圖1 MicroreaderTM 21 ID 系統(tǒng)檢測圖譜Fig.1 Genotyping of MicroreaderTM 21 ID System

母親與孩子在FGA基因座分型分別為“17.2，22，24.2”及“17.2，24，24.2”，出現(xiàn)3 個等位基因，其他基因座未出現(xiàn)明顯異常，更換試劑盒進行驗證。

1.2.2 復(fù)檢

采用人類DNA 分型盒（白金）（深圳華大法醫(yī)科技有限公司）重新擴增母親與孩子血樣（圖2）發(fā)現(xiàn)，母子FGA基因座分型為“22，24.2”“24，24.2”，均為雜合子，沒有MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)檢測出的“17.2”等位基因，在vWA基因座卻出現(xiàn)三等位基因現(xiàn)象。對照MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)分型結(jié)果，母親及孩子vWA基因座分型在“14，18”及“14，17”以外，均出現(xiàn)了一個off-ladder 峰（以下簡稱OL 峰），片段長度分別為305.93、305.78 bp，按照片段長度，應(yīng)標記為14.2。

圖2 人類DNA 分型盒（白金）檢測圖譜Fig.2 Genotyping of Human DNA Typing Kit（Platinum）

比對初次檢驗與復(fù)檢結(jié)果，推測2 個基因座的三等位基因中的一個來自較目標基因座片段稍短的D2S1338。

1.2.3 測序與結(jié)果

將母親與孩子的樣本的D2S1338基因座進行克隆測序，結(jié)果顯示：母親與孩子的D2S1338基因座均分別檢出18、36 個重復(fù)單位，其中等位基因18 包括7 個TGCC 重復(fù)和11 個TTCC 重復(fù)；母親的等位基因36 包 括7 個TGCC 重 復(fù)、27 個TTCC 重 復(fù) 和2 個GTCC重復(fù)；孩子的等位基因36 包括7 個TGCC 重復(fù)、26 個TTCC 重復(fù)、1 個TTAC 重復(fù)和2 個GTCC 重復(fù)。

1.2.4 鑒定意見

根據(jù)母親參與下累積父權(quán)指數(shù)（cumulative paternity index，CPI）計算公式[1]，計算得到CPI值為1.70×1010，支持被檢父為孩子的生物學(xué)父親。

2 討論

短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）是廣泛存在于人類基因組中的一類具有高度多態(tài)性的遺傳標記，具有分布廣泛、多態(tài)性高、可復(fù)合擴增的優(yōu)點，是目前全世界法醫(yī)DNA 實驗室運用最廣泛的一類遺傳標記[2]。一般情況下，人常染色體單個STR 基因座的等位基因分型表現(xiàn)為純合子或雜合子，純合子含有兩個相同的等位基因（約占10%），雜合子即含有兩個不同的等位基因（約占90%）[3]。在極個別情況下，單個STR 分型圖譜會出現(xiàn)3 條等位基因，國內(nèi)外文獻[4-6]推測是由于染色體非整倍體、減數(shù)分裂期間同源染色體發(fā)生錯位配對和重組而造成染色體內(nèi)部分片段重復(fù)、嵌合體以及體細胞突變等原因形成。

本案中，MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)檢測的FGA基因座分型結(jié)果出現(xiàn)三等位基因，用人類DNA 分型盒（白金）驗證，該基因座出現(xiàn)正常的雜合分型，而原正常雜合分型的vWA基因座出現(xiàn)了三等位基因，推測兩個基因座可能并非真正存在三等位基因。在MicroreaderTM21 ID 系統(tǒng)檢測圖譜中，出現(xiàn)三等位基因的FGA基因座為紅色熒光標記的最大片段基因座，其后無相同熒光標記的基因座，比FGA基因座片段稍短的D2S1338基因座只有1 個等位基因；在人類DNA 分型盒（白金）檢測圖譜中，vWA基因座出現(xiàn)三等位基因，較vWA片段稍長的Penta E基因座有峰值比較接近的兩個等位基因，比vWA基因座片段稍短的D2S1338基因座同樣只有1 個等位基因，其余均無異常?？梢钥闯?，2 種試劑盒出現(xiàn)三等位基因的基因座均與D2S1338相鄰，且該基因座只檢出1個等位基因。推測FGA和vWA基因座異常增加的等位基因可能來自D2S1338基因座。根據(jù)2 種試劑盒等位基因分型標準物，分別計算異常等位基因，其結(jié)果均為36個重復(fù)單位。

通過克隆測序檢測D2S1338基因座序列，得到準確的等位基因分型，證實了上述結(jié)果。在D2S1338基因座等位基因36 中，核心重復(fù)序列與《法醫(yī)物證學(xué)》[7]中提到D2S1338基因座核心序列TTCC 及TGCC 不同。本案中，母親及孩子的D2S1338基因座等位基因36 除了上述2 種核心序列，還出現(xiàn)了GTCC 及TTAC。另外，發(fā)現(xiàn)母子核心序列不一致。母親為7 個TGCC重復(fù)、27 個TTCC 重復(fù)和2 個GTCC 重復(fù)，孩子為7 個TGCC重復(fù)、26個TTCC重復(fù)、1 個TTAC 重復(fù)和2 個GTCC 重復(fù)，母子的TTCC 重復(fù)數(shù)量不同，推測應(yīng)該是1 個TTCC 核心序列中C 堿基突變?yōu)锳，導(dǎo)致以上結(jié)果。

通過本案例，提示在實際檢案工作中對于檢測出的三等位基因，必須采用其他試劑盒進行驗證，排除擴增及檢測過程造成的漂移，甚至如本案這種非常稀有的超長基因等情況，必要時應(yīng)通過測序確定基因座序列，使鑒定結(jié)果更加準確。