李紅輝, 唐石歡, 張先平△, 龍婷, 彭露, 張慧, 吳沁園, 張紅梅, 王亞平

婁底市中心醫(yī)院 1中醫(yī)科， 2生殖中心(湖南婁底 417000)； 3重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室(重慶 400016)

目前人們在對衰老有關(guān)機(jī)制深入研究的同時，對抗衰老藥物的研發(fā)也正在逐步深入。中醫(yī)藥博大精深、抗衰老在我國歷史悠久，鑒于其是整體均衡調(diào)節(jié)且不良反應(yīng)較少等優(yōu)勢在延緩衰老進(jìn)程當(dāng)中發(fā)揮獨特的作用。當(dāng)歸中最主要的活性成分之一就是當(dāng)歸多糖(angelica sinensis polysaccharide，ASP)，ASP具有抗輻射、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)造血、抗腫瘤等作用[1-5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator factor 2-related enzyme 1，SIRT1)作為依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的Ⅲ型組蛋白/蛋白質(zhì)脫乙?；钢械囊粏T，在細(xì)胞壽命延長和衰老、炎癥以及抗氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[6]。2017年1月至2020年4月，本研究擬在課題組前期已構(gòu)建的衰老造血干細(xì)胞(HSCs)模型的基礎(chǔ)上[7]，觀察ASP對X線輻射致小鼠衰老HSCs SIRT1、p53及p21蛋白表達(dá)的影響，探討ASP基于調(diào)控HSCs衰老的可能機(jī)制，為預(yù)防衰老以及抗衰老治療提供更為可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑 ASP由陜西慈緣生物技術(shù)有限公司提供(純度≥95%)；Anti-Sca-1 MicroBead Kit購于Miltenyi公司；SA-β-Gal Staining Kit購于Cell Signaling公司；淋巴細(xì)胞分離液購于Axis-Shield公司；MethoCult GF M3434購于Stem Cell Technologies公司；SIRT1兔抗羊抗體購于Abcam公司，p53、p21兔抗鼠多克隆抗體購于Bioworld Technology公司；BCA蛋白相關(guān)試劑盒購于Pierce公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗試劑盒、內(nèi)參GAPDH抗體購于Jackson公司。

1.2 動物分組及處理 72只由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心[合格證號：SCXK(渝)2007-0001]提供的SPF級C57BL/6J小鼠，6～8周齡、16～20 g/只，雌∶雄為1∶1。將小鼠隨機(jī)納入對照組、模型組和ASP組，每組24只。ASP組和模型組均用3.0 Gy X線照射全身(照射能量為6 MeV，時間1 min，高度100 cm，面積25 cm×25 cm)，每10 d 1次，共照射8次，總計24 Gy，照射當(dāng)天分別給予200 mg/kg ASP和等容量生理鹽水灌胃，隔天1次，共灌胃40次[7]，對照組予生理鹽水。在末次照射后的第10天予拖頸法處死小鼠。

1.3 HSCs分離與純化 處死小鼠后在無菌條件下分別取出股骨、脛骨，1640培養(yǎng)基沖洗骨髓，制單細(xì)胞懸液，通過淋巴細(xì)胞分離液分離出骨髓單個核細(xì)胞。采用干細(xì)胞抗原(Sca-1)鑒定、分選HSCs，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Sca-1+細(xì)胞比值，即HSCs純度[7]。

1.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 分別收集3組小鼠Sca-1+HSCs，PBS洗滌、冰乙醇固定過夜，離心、留取沉淀，再次PBS洗滌，加牛胰核糖核酸酶，于37℃準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，再予碘化丙啶(PI)避光孵育30 min后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，通過Multicycle分析軟件了解細(xì)胞周期分布情況。

1.5 HSCs混合集落培養(yǎng) 分別收集3組小鼠Sca-1+HSCs，經(jīng)培養(yǎng)基洗滌后離心棄上清，加入1 mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)基并充分混勻，隨后接種96孔板，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育11～12 d，按照接種HSCs與混合集落形成單位(colony forming unity-mixture，CFU-Mix)的數(shù)量評價HSCs的多向分化潛能。

1.6 SA-β-Gal染色檢測衰老細(xì)胞 分別收集3組小鼠Sca-1+HSCs，經(jīng)洗滌后離心棄上清，加入固定液震蕩混勻，于室溫固定10 min，再次洗滌并離心后棄上清，加入固定液充分混勻，置于無CO2條件下37℃孵育染色12～16 h，涂片(細(xì)胞數(shù)約為1×104個/張)，甘油封片后鏡檢。隨機(jī)檢測400個細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞形態(tài)、計算陽性細(xì)胞率。SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率(%)=(觀察陽性細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.7 Western blot法檢測SIRT1、p53、p21蛋白表達(dá) 收集各組小鼠Sca-1+HSCs，分別提取蛋白樣品，按照BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉。SIRT1一抗(1∶400)、p53一抗(1∶500)、p21一抗(1∶500)及GAPDH抗體(1∶500)4℃孵育過夜，加入二抗孵育1 h，經(jīng)ECL發(fā)光顯色，Quantity-One軟件分析蛋白表達(dá)情況(目的條帶同GAPDH條帶吸光度的比值即為目的蛋白表達(dá)量)。

2 結(jié)果

2.1 HSCs分離與純化 分選前骨髓單個核細(xì)胞中Sca-1+細(xì)胞百分比為(11.45±1.87)%，經(jīng)分離純化后Sca-1+細(xì)胞純度達(dá)(86.21±6.17)%，提示經(jīng)流式細(xì)胞儀測定分選的小鼠Sca-1+HSCs可能具有較高純度。

2.2 HSCs 細(xì)胞周期比例 與對照組比較，模型組HSCs G1期比例顯著增加、S期比例顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，ASP組HSCs G1期比例減少及S期比例增加(P<0.05)。見表1、圖1。

表1HSCs 細(xì)胞周期分布與CFU-Mix數(shù)量

注：A：對照組；B：模型組；C：ASP組

2.3 HSCs CFU-Mix形成能力 與對照組比較，模型組HSCs 形成的CFU-Mix數(shù)量減少(P<0.05)；與模型組比較，ASP能抑制HSCs形成CFU-Mix數(shù)量減少(P<0.05)。見表1、圖2。

注：A：對照組；B：模型組；C：ASP組

2.4 HSCs SA-β-Gal染色 SA-β-Gal染色顯示：陽性細(xì)胞(衰老細(xì)胞)體積較大、胞質(zhì)呈藍(lán)色，而陰性細(xì)胞未著色。與對照組[(9.91±1.08)%]比較，模型組HSCs SA-β-Gal染色陽性率為(54.14±5.58)%，明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，ASP組HSCs SA-β-Gal染色陽性率為(11.42±1.07)%，明顯降低(P<0.05)。見圖3。

注：A：對照組；B：模型組；C：ASP組

2.5 HSCs SIRT1、p53、p21蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組HSCs SIRT1蛋白表達(dá)減少(P<0.01)、p53和p21蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，ASP組HSCs SIRT1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)、p53和p21蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 HSCs SIRT1、p53、p21蛋白表達(dá)

圖4 HSCs SIRT1、p53、p21蛋白表達(dá)水平

3 討論

隨著人口出生率的下降及平均壽命的增加，伴隨衰老相關(guān)疾病的發(fā)病率亦逐年升高[8-9]。目前衰老與抗衰老相關(guān)研究已日益成為各領(lǐng)域關(guān)注的熱點和焦點。衰老涉及多器官、細(xì)胞參與，與多種信號通路觸發(fā)緊密相關(guān)。SIRT1是目前衰老研究中較為熱門、廣泛的蛋白，其可能會通過抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控新陳代謝以及抑制炎癥等來延緩細(xì)胞衰老[10]。已有研究報道SIRT1可能參與調(diào)控p53、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FOX1)、炎性小體3(NLRP3)、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)等信號通路[11-12]。SIRT1涉及的氧化還原相關(guān)靶分子主要為p53和FOX，而p53在調(diào)節(jié)SIRT1氧化還原相關(guān)反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。p53是SIRT1的重要下游信號通路，活性形式為乙?；痯53蛋白，可能具有促進(jìn)細(xì)胞衰老的作用[13]。SIRT1和p53的活性可能存在相互調(diào)節(jié)作用，在SIRT1啟動子區(qū)域中可能存在p53結(jié)合位點，SIRT1通過使p53去乙酰化來抑制p53依賴性轉(zhuǎn)錄和凋亡，從而修復(fù)因應(yīng)激引起的DNA損傷，可能減少細(xì)胞凋亡[14]。此外，近幾十年來研究發(fā)現(xiàn)，中藥的活性成分可能治療多種衰老相關(guān)疾病動物模型[15]。故本研究在前期已經(jīng)構(gòu)建小鼠HSCs衰老模型的基礎(chǔ)上選用中藥ASP干預(yù)[7]，探索ASP的干預(yù)作用及其延緩衰老的潛在作用機(jī)制。

p53/p21信號通路是較為經(jīng)典的與細(xì)胞衰老有關(guān)的信號通路，但是它涉及的上游與下游的具體調(diào)控基因尚不明確。p53蛋白可特異性結(jié)合DNA，通過泛素化、乙?；确g后修飾調(diào)控細(xì)胞周期的啟動[16]，在某些細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)時(譬如存在癌基因及DNA損傷)時被激活。正常情況的“分子警察”p53可在G1期對DNA損傷點進(jìn)行檢查、并對各種信號進(jìn)行整合，以判斷基因組是否完整，如發(fā)現(xiàn)DNA損傷將阻止DNA進(jìn)行復(fù)制，并會提供足夠的時間修復(fù)，若不能成功修復(fù)損傷DNA時可能通過調(diào)節(jié)不同靶蛋白如：還原型煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸磷酸(NADPH)的胞質(zhì)亞單位嗜中性粒細(xì)胞胞漿因子(NCF2/p67phox)、p53誘導(dǎo)蛋白、銜接蛋白(p66Shc)、凋亡基因(Bax)等促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。本研究中，模型組HSCs G1期比例、p53、p21蛋白表達(dá)及SA-β-Gal染色陽性率均顯著增加，但予以ASP干預(yù)后HSCs G1期比例、p53、p21蛋白表達(dá)及SA-β-Gal染色陽性率均顯著降低、且S期及CFU-Mix數(shù)量增加。故認(rèn)為小鼠p53蛋白的激活可促使p21蛋白的轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)而將細(xì)胞周期阻滯在G1期，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞衰老[13]；這進(jìn)一步證實了前期研究：經(jīng)ASP干預(yù)后可能顯著改善HSCs G1期阻滯及SA-β-Gal染色陽性率的增加，下調(diào)p53、p21蛋白表達(dá)，進(jìn)而延緩細(xì)胞衰老進(jìn)程[18]。

新近研究表明，p53蛋白是SIRT1的重要下游信號通路，可能被SIRT1調(diào)控[11-12，19]。SIRT1作為一種脫乙酰酶，可能導(dǎo)致某些衰老蛋白(如p53、p21蛋白)去乙酰化失活延緩細(xì)胞衰老、降低核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)，從而直接或間接地參與衰老信號通路的調(diào)控[20-22]。在細(xì)胞DNA損傷等應(yīng)激狀態(tài)下，p53蛋白的表達(dá)和積累增加，若SIRT1激活則可使p53蛋白C端的第382位賴氨酸殘基處于去乙?；癄顟B(tài)，降低p53作為轉(zhuǎn)錄激活因子的活性，可能阻止p53途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和(或)生長抑制，從而延長細(xì)胞壽命[23]。本研究中模型組HSCs衰老染色陽性率、G1期比例、p53和p21表達(dá)增加的同時SIRT1表達(dá)反而降低；但經(jīng)ASP干預(yù)后HSCs SIRT1表達(dá)增加、且衰老染色陽性率、G1期比例、p53和p21表達(dá)均降低，這與上述研究報道相吻合。推測ASP干預(yù)后可能使HSCs中SIRT1的表達(dá)增加、使p53去乙?；Щ?，從而減少活性p53的含量，致下游基因p21轉(zhuǎn)錄的活性降低，直接或間接地影響p53/p21通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞衰老[24-26]。

綜上所述，ASP可能通過增加SIRT1表達(dá)、下調(diào)p53及p21蛋白的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期，以延緩衰老。但本研究中未據(jù)ASP干預(yù)行劑量-效應(yīng)分析，結(jié)合目前SIRT1具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，課題組后續(xù)將進(jìn)一步完善并探索ASP最佳給藥劑量、更深入地探索SIRT1延緩衰老的具體分子機(jī)制。